معلومة

2.8: مقدمة - علم الأحياء

2.8: مقدمة - علم الأحياء



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

الحمض النووي والحمض النووي الريبي كلاهما احماض نووية، وهي الأحماض البوليمرية المعزولة من نواة الخلايا. يمكن تمثيل DNA و RNA كسلاسل بسيطة من الحروف ، حيث يتوافق كل حرف مع حرف معين النوكليوتيدات، المكون الأحادي لبوليمرات الحمض النووي. سيتم في هذا الفصل مراجعة الدليل على أن الأحماض النووية هي المادة الوراثية ، ومن ثم استكشاف التركيب الكيميائي للأحماض النووية.

التهجين لطخة الجنوبية

بعد الفصل بالرحلان الكهربي ، تُنقل شظايا الحمض النووي إلى غشاء (نايلون أو نيتروسليلوز) وتثبت ؛ تسمى هذه النسخة المتماثلة لنمط الحمض النووي في الهلام "لطخة". يتم تهجين مسبار محدد المسمى إلى اللطخة لاكتشاف التسلسلات ذات الصلة. بعد غسل المسبار غير المرتبط بشكل محدد ، يتم الكشف عن الهجينة المحددة بواسطة التصوير الشعاعي الذاتي للبقعة.

الشكل 2.28: رسم تخطيطي للنشاف الجنوبي. يتم فصل الحمض النووي الجيني الذي تم هضمه بإنزيم تقييد على هلام الاغاروز ، ثم يتم نقل الحمض النووي من الجل إلى غشاء نايلون (صفيحة رمادية) عن طريق النشاف. يتم تثبيت الحمض النووي على الغشاء ، ثم يتم فحصه باستخدام جزء من الحمض النووي المسمى إشعاعيًا مكملًا للتسلسل المستهدف. بعد الغسيل الصارم ، يتم تعريض اللطخة لفيلم الأشعة السينية لاكتشاف الحجم الذي يرتبط به المسبار. في هذه الحالة ، يرتبط المسبار بأجزاء مختلفة الحجم في الممرات 1 و 2 و 3. في الصورة الأخيرة ، يمثل اللون البرتقالي موضع الحمض النووي المهضوم ، لكنه غير موجود فعليًا في فيلم الأشعة السينية. (الأصل- J. Locke-CC: AN)

يمكن استخدام مواقع التقييد كعلامات وراثية. يمكن للمرء تحديد القيود تعدد الأشكال في طول الجزء (RFLPs) التي ترتبط بموقع معين. يمكن استخدام هذا ل

  1. تطوير اختبار تشخيصي لموضع المرض (مثل مرض فقر الدم المنجلي)
  2. ساعد في عزل الجين.
  3. بصمة الحمض النووي للمواقع شديدة التغير.

أحجام الحمض النووي والكروموسومات وطرق حلها

يعرض الشكل التالي آراء الكروموسومات وأجزاء الحمض النووي على أربعة مقاييس مختلفة ومتوسعة. يقارن المستوى الأعلى أحجام الكروموسومات السليمة من أربعة من الكائنات الحية التي سنناقشها في هذه الدورة. ثم يتم توسيع مقياس كروموسوم الخميرة III بحيث يمكن مقارنته ببعض الجينومات الفيروسية والبلازميدية الشائعة الاستخدام. بعد ذلك ، يتم تقديم عرض أعلى دقة للبلازميد pBR322 ، وأخيرًا أعلى دقة نحن نهتم بها عادة ، أي تسلسل النوكليوتيدات.

الشكل 2.29.

تحديد تسلسل DNA و RNA

النهج الأساسي هو توليد مجموعة متداخلة من الحمض النووي فتاتالتي تبدأ موقعًا مشتركًا و تنتهي بحرف A أو G أو C أو T.. يتم فصل هذه المجموعات من شظايا الحمض النووي (المسمى) على هلام بولي أكريلاميد الذي يفسد الطبيعة بدقة 1 نقطة أساس. يسمح النمط الناتج بقراءة التسلسل. كان التعديل الكيميائي الخاص بالقاعدة والتحلل ، الذي طوره ماكسام وجيلبرت ، نهجًا مستخدمًا على نطاق واسع. يمكن استخدام الانقسام النوعي للنيوكليوتيدات من RNA بواسطة مجموعة من Rnases لتسلسل الحمض النووي الريبي. سنركز على الطريقة الأكثر شيوعًا لتسلسل الحمض النووي ، وهي طريقة إنهاء السلسلة الخاصة بالنيوكليوتيدات.

ال إنهاء سلسلة ديديوكسينوكليوتيد طريقةتم تطويره في مختبر فريد سانجر في كامبريدج. يمكن دمج ديديوكسينوكليوتيد 2 '، 3' في DNA ، وفقًا لتوجيهات حبلا القالب. ومع ذلك ، فإن المفقود 3’-أوه يحول دون مزيد من البلمرة. ومن ثم تنتهي السلسلة المركبة حديثًا من النيوكليوتيدات عند قاعدة محددة, سلسلة تنتهي ديديوكسينوكليوتيد. يتم تشغيل التفاعلات بحيث تنتهي جميع المنتجات بالحرف G أو C أو A أو aT ، ولكنها تبدأ جميعها في نفس المكان. يؤدي هذا إلى إنشاء مجموعة متداخلة من المنتجات التي يكون طولها مقياسًا لموضع كل G في تسلسل مستهدف ، أو كل C ، إلخ. وبالتالي يمكن للمرء أن يستنتج أن التسلسل المستهدف مكمل ، على سبيل المثال G في الموضع 1 ، T في الموضع 2 ، C في الموضعين 3 و 4 ، إلخ. لمئات من النيوكليوتيدات في كل شوط.

بمزيد من التفصيل ، يتم تلدين مادة أولية محددة بالقالب ، من المنطقة المراد تسلسلها. سيحفز بوليميراز الحمض النووي تخليق الحمض النووي الجديد من الطرف الثالث لهذا التمهيدي (الاستطالة). وبالتالي ، فإن التمهيدي يولد نهاية مشتركة لجميع أجزاء المنتج. (هذا هو أساس المجموعة المتداخلة في هذا الأسلوب).

يتم تمييز الحمض النووي المُصنَّع إما بالنيوكليوتيدات المشعة ، مثل [a35S] deoxy ‑ thio ‑ ATP ، أو الصبغة الفلورية ، التي غالبًا ما تعلق على التمهيدي.

يتم تضمين فاصل سلسلة خاص بالقاعدة في كل تفاعل من التفاعلات الأربعة:

  • 2 '، 3' dideoxyGTP في تفاعل "G".
  • 2 '، 3' dideoxyATP في تفاعل "A".
  • 2 '، 3' dideoxyTTP في تفاعل "T".
  • 2 '، 3' dideoxyCTP في تفاعل "C".

سوف يطول بوليميريز الحمض النووي من كل أساس صلب حتى يشتمل على 2 '، 3' ديديوكسينوكليوتيد. لا يمكن إضافة أي نيوكليوتيدات إضافية إلى هذا المنتج ، نظرًا لأنه لا يحتوي على 3 'OH ، وبالتالي فهو عبارة عن فاصل سلسلة. يحدث هذا الإنهاء فقط عند البقايا G (مكملة لـ C في القالب) في تفاعل "G" ، فقط عند البقايا A في التفاعل "A" ، إلخ. وبالتالي ، تشتمل منتجات كل تفاعل على مجموعة متداخلة من الأجزاء ، مع التمهيدي المحدد في الطرف 5 ونهاية السلسلة الخاصة بالقاعدة في النهاية 3. يتم حل المنتجات على هلام التسلسل ، وعرضها لفيلم الأشعة السينية وقراءة التسلسل ، كما في الشكل 2.30.

الشكل 2.30. سلسلة إنهاء سلسلة سانجر ديديوكسينوكليوتيد.

نهج إنهاء سلسلة ديديوكسينوكليوتيد هو الطريقة المستخدمة في المتسلسلات الآلية. يتم تضمين أصباغ فلورية ملونة مختلفة (عادة ما يتم إرفاقها بالبادئة) في كل تفاعل خاص بالقاعدة. لذلك يمكن تشغيل منتجات الأربعة في حارة واحدة من هلام التحليل ، مما يسمح بتحليل أكثر من 20 مجموعة تسلسل في وقت واحد. يمسح الليزر باستمرار على طول منطقة واحدة من الهلام ، ويسجل عند اكتشاف (على سبيل المثال) تألق أحمر أو أخضر أو ​​أزرق أو أصفر في كل حارة ، مما يعني أن التمهيدي يمتد إلى (على سبيل المثال) A أو G أو C أو T يمر عبر منطقة الكشف. تتم معالجة هذه البيانات تلقائيًا ، ويتم إنشاء قراءة مع القمم لكل صبغة فلورية كدالة لوقت تشغيل الهلام والتسلسل المستنتج. يظهر مثال للإخراج أدناه باللونين الأبيض والأسود ؛ الناتج الأصلي ملون (لون مختلف لكل نوكليوتيد). يمكن إجراء التحرير اليدوي للتسلسل المستنتج بناءً على البيانات الأولية ، ولكن في مشاريع التسلسل واسعة النطاق ، يتم تحديد كل منطقة حوالي 8 مرات مختلفة ويتم استخدام برامج أخرى لتحديد النوكليوتيدات الأكثر تكرارا في كل موضع.

قدرة آلات التسلسل الآلي غير عادية. تستخدم الآلات الجديدة التي تستخدم الرحلان الكهربائي للهلام الشعري لتوليد ملايين النيوكليوتيدات يوميًا في مراكز التسلسل الرئيسية. تسمح هذه التقنية بتسلسل الجينومات الكبيرة والمعقدة بسرعة ، كما تمت مناقشته في الفصل 4.

الشكل 2.31. مثال على الإخراج من التسلسل الآلي للديديوكسينوكليوتيد. مثال على نتائج تسلسل الحمض النووي الآلي لإنهاء السلسلة. (سيسي بي-سا 3.0 ؛ أبيزار لاكدوالا).

الالتواء الفائق للحمض النووي المقيد طوبولوجيًا

يمكن أن يكون الحمض النووي المغلق طوبولوجيًا دائريًا (دوائر مغلقة تساهميًا) أو حلقات مقيدة في القاعدة. يسمى اللف (أو الالتفاف) للحمض النووي المزدوج حول محوره الالتفاف الفائق (الشكل 2.32 الأوسط).

  • نفي تقوم اللفائف الفائقة بلف الحمض النووي حول محوره في الاتجاه المعاكس من المنعطفات في اتجاه عقارب الساعة للحلزون المزدوج الأيمن (RH).
  • سلبيًا الحمض النووي فائق الالتفاف هو تحت الجرح (وبالتالي يفضل فك الازدواج).
  • يحتوي الحمض النووي ذو الالتفاف الفائق سلبًا على لفائف R-H الفائقة (الشكل 2.32).
  • إيجابي تقوم اللفائف الفائقة بتدوير الحمض النووي في نفس اتجاه دوران اللولب المزدوج R-H.
  • الحمض النووي فائق الالتفاف إيجابيًا هو فوق الجرح (يتم لف اللولب بإحكام أكثر).
  • يحتوي الحمض النووي فائق الالتفاف إيجابيًا على لفائف L-H الفائقة.

تولد المنعطفات في اتجاه عقارب الساعة للحلزون المزدوج R-H (النموذج A أو B) موجبًا إلتواء (T) ؛ انظر الشكل 2.32 اليسار. تؤدي دورات couterclock في اتجاه عقارب الساعة (ccw) لـ L-H helix (Z) إلى توليد T.

تي= عدد التواء

  • بالنسبة للحمض النووي من النوع B ، يكون + (# bp / 10 bp لكل تطور)
  • بالنسبة إلى الحمض النووي للنموذج ، يكون + (# bp / 11 نقطة أساس لكل تطور)
  • بالنسبة إلى Z DNA ، يكون - (# bp / 12 bp لكل تطور)

دبليو= يتلوى عددهو تحول محور الحمض النووي مزدوج في الفضاء

  • الجزيء المريح W = 0
  • الفائق السالبة ، W سلبي
  • الملفات الفائقة الإيجابية ، W موجبة

إل= رقم الربط= إجمالي عدد المرات الذي يحيط (أو يربط) خيط واحد من اللولب المزدوج (لجزيء مغلق) الآخر.

[L = W + T ]

  • لا يمكن أن يتغير L ما لم يتم كسر أحد الخيوط أو كلاهما وإصلاحه.
  • يتم تقسيم التغيير في رقم الربط ، DL ، بين T و W (الشكل 2.32 على اليمين). هكذا:

[DL = DW + DT ]

إذا (DL = 0 ) ، (DW = -DT )

الشكل 2.32. العلاقة بين الالتواء الفائق والالتواء. رسم يوضح الفرق بين كروموسوم DNA دائري (بلازميد) مع تطور حلزوني ثانوي فقط ، والآخر يحتوي على التفاف إضافي فوق الحلزوني ثالثي مركب على الملف الحلزوني الثانوي. (CC BY-SA 3.0 ؛ JoKalliauer).

بروميد إيثيديوم مقحمة في الحمض النووي ، و يحل (أو يحل) المزدوج بمقدار 27 درجة لكل جزيء من بروميد الإيثيديوم مقسم. وبالتالي فإن إقحام 14 جزيءًا من بروميد الإيثيديوم سيؤدي إلى تفكيك الازدواج بمقدار 378 درجة ، أي أكثر بقليل من التفاف واحد كامل (والذي سيكون 360 درجة). بالنسبة لعملية الإقحام هذه ، DL = 0 ، حيث لا يتم كسر أو إصلاح أي روابط تساهمية في الحمض النووي. التغيير في اللف ، DT ، سلبي ، وبالتالي فإن DW إيجابي. وبالتالي ، يمكن أن يؤدي إقحام بروميد الإيثيديوم إلى إرخاء دائرة سالبة الالتفاف ، وسيؤدي المزيد من الإقحام إلى جعل الحمض النووي ملفوفًا بشكل إيجابي (الشكل 2.33).

الشكل 2.33.

من المفيد أن يكون لديك تعبير عن الالتفاف الفائق مستقل عن الطول. ال الكثافة الفائقة هو ببساطة عدد الدورات الفائقة (SH) في كل منعطف (أو تطور) من اللولب المزدوج.

[ text {كثافة فائقة} = s = dfrac {W} {T} ]

هذا هو -0.05 للحمض النووي البكتيري الطبيعي. على سبيل المثال ، في الحمض النووي البكتيري ، هناك 1 سلبي S.H. لفة لكل 200 نقطة أساس (محسوبة من دورة SH سالبة واحدة لكل 20 لفات = 1 دورة SH سلبية لكل 200 نقطة أساس)

يحتوي الحمض النووي السالب فائق الالتفاف على طاقة مخزنة تفضل الفك ، أو الانتقال من الشكل B إلى Z DNA.

ل س = -0.05 ، ( Delta G = -9 Kcal / mole ) ، مما يفضل الفك

وبالتالي ، فإن الالتفاف الفائق السلبي يمكن أن يفضل بدء النسخ وبدء النسخ المتماثل.

توبويزوميراز

تحفز Topoisomerases تغييرًا في عدد ربط الحمض النووي.

  • Topo I = إنزيم مغلق ، يمكنه استرخاء الحمض النووي فائق الالتواء الإيجابي أو السلبي ، مما يجعل فاصلًا عابرًا في حبلا واحد. E. القولونية Topo I على وجه التحديد يريح الحمض النووي فائق الالتفاف سلبيًا. العجل الغدة الصعترية Topo I يعمل على الحمض النووي فائق الالتفاف سلبًا وإيجابيًا.
  • Topo II = gyrase: يستخدم طاقة التحلل المائي ATP لإدخال لفائف سالبة سالبة. وتتمثل آلية عملها في كسر حبلا مزدوج عابر ، وتمرير الحمض النووي المزدوج من خلال الكسر ، ثم إعادة ختم الكسر.
قياس التغيير في رقم الربط

يمكن للمرء قياس التغيير في رقم الربط (DL) عن طريق الترسيب أو الرحلان الكهربائي أو المجهر الإلكتروني ، كما هو موضح في الشكل 2.34.

الشكل 2.34.


شاهد الفيديو: Introduction to Microbiology. علم الأحياء الدقيقة الكائنات الدقيقة الجراثيم أوالميكروبيولوجي (أغسطس 2022).