معلومة

توجيه RNAs و SNPs لتخصيب nanopore

توجيه RNAs و SNPs لتخصيب nanopore



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

في أي جزء من تسلسل جرنا هو الأكثر أهمية عدم الحصول على تعدد الأشكال؟ أعلم أن موقع PAM لا يمكن أن يحتوي على أي SNPs ولكن ماذا عن المواقع الأخرى؟ وثانيًا ، هل هناك أية مواقف في تسلسل الجرنا يكون من المقبول أن يكون فيها تعدد الأشكال؟


التنميط الشامل لل RNAs دائرية مع تسلسل نانوبور و CIRI طويل

أثبتت إعادة بناء تسلسل الحمض النووي الريبي الدائرية (CircRNAs) من قراءات تسلسل الحمض النووي الريبي القصيرة أنها صعبة بالنظر إلى تشابه الجزيئات الحلقية والرسول الخطي المقابل لها. لم تكن طرق التسلسل السابقة قادرة على تحقيق الكشف عن الإنتاجية العالية للحلقات الحلقية كاملة الطول. نحن هنا نصف بروتوكول للتخصيب والتسلسل الكامل للأشكال الإسوية الحلقية باستخدام تقنية المسام النانوية. يحقق النسخ العكسي الدائري واختيار الحجم إثراءً أعلى بمقدار 20 ضعفًا من الحمض النووي الريبي من إجمالي الحمض النووي الريبي مقارنة بالطرق السابقة. لقد طورنا خوارزمية ، تسمى معرف سيرنا باستخدام بيانات التسلسل طويلة القراءة (CIRI-long) ، لإعادة بناء تسلسل الجزيئات الحلقية. تم التحقق من صحة سير العمل من خلال البيانات المحاكاة وبالمقارنة مع تسلسل Illumina وكذلك الوقت الحقيقي الكمي RT-PCR. استخدمنا CIRI-long لتحليل عينات دماغ فأر بالغ وملف تعريف منهجي للحلقات الحلقية ، بما في ذلك الدوائر الحلقية المشتقة من الميتوكوندريا والنسخية. حددنا نوعًا جديدًا من الحمض النووي الريبي intronic الذاتي المربوط والذي يعرض أنماطًا خاصة من الربط والتعبير. تستفيد طريقتنا من قراءات طويلة من nanopore وتتيح إعادة البناء غير المتحيزة لتسلسلات CircRNA كاملة الطول.


Wu، W.، Ji، P. & amp Zhao، F. جينوم بيول. 21, 101 (2020).

Zheng، Y.، Ji، P.، Chen، S.، Hou، L. & amp Zhao، F. جينوم ميد. 11, 2 (2019).

شين ، آر وآخرون. نات. كومون. 12, 266 (2021).

تشين ، ل. نات. القس مول. خلية بيول. 21, 475–490 (2020).

Logsdon، G.A، Vollger، M.R & amp Eichler، E. E. E. نات. القس جينيه. 21, 597–614 (2020).

جاو ، واي وآخرون. نات. كومون. 7, 12060 (2016).

تشاو ، كيو وآخرون. زنزانة 183، 76–93.e22 (2020).

ليجنيني ، آي وآخرون. مول. زنزانة 66، 22–37 هـ 9 (2017).

ليو ، C.-X. وآخرون. زنزانة 177، 865-880 هـ 21 (2019).


مراجع

Karamitros، T. & amp Magiorkinis، G. التسلسل المستهدف المتعدد لـ Oxford Nanopore MinION: إجراء تفصيلي لإعداد المكتبة. طرق مول. بيول. 1712, 43–51 (2018).

Leija-Salazar، M. et al. تقييم اكتشاف طفرات GBA الخاطئة والمتغيرات الأخرى باستخدام Oxford Nanopore MinION. مول. جينيه. جينوم. ميد. 7، e564 (2019).

غابرييلي ، ت. وآخرون. التسلسل النانوي الانتقائي للإنسان BRCA1 عن طريق الاستهداف بمساعدة Cas9 لشرائح الكروموسوم (CATCH). الدقة الأحماض النووية. 46، e87 (2018).

جيسلمان ، ب. وآخرون. تحليل التوسعات المتكررة الترادفية القصيرة وحالة المثيلة مع تسلسل النانو. نات. التكنولوجيا الحيوية. 37, 1478–1481 (2019).

Kozarewa، I.، Armisen، J.، Gardner، A.F، Slatko، B. E. & amp Hendrickson، C.L. نظرة عامة على استراتيجيات تخصيب الهدف. بالعملة. بروتوك. مول. بيول. 112, 7.21.1–7.21.23 (2015).

إيبرل ، إم إيه وآخرون. مجموعة بيانات مرجعية من 5.4 مليون متغير بشري مرحلي تم التحقق من صحتها عن طريق الوراثة الجينية من تسلسل ثلاثة أجيال من 17 عضوًا. الدقة الجينوم. 27, 157–164 (2017).

ENCODE Project Consortium. موسوعة متكاملة لعناصر الحمض النووي في الجينوم البشري. طبيعة سجية 489, 57–74 (2012).

Sternberg ، S.H ، Redding ، S. ، Jinek ، M. ، Greene ، E.C & amp Doudna ، J. A. طبيعة سجية 507, 62–67 (2014).

فوربس ، إس إيه وآخرون. COSMIC: علم الوراثة الجسدي للسرطان بدقة عالية. الدقة الأحماض النووية. 45، D777-D783 (2017).

لي وآخرون. التنميط المتزامن لإمكانية الوصول إلى الكروماتين والميثلة على خطوط الخلايا البشرية مع تسلسل النانو. ما قبل الطباعة في bioRxiv https://doi.org/10.1101/504993 (2018).

ميسيير ، ت.ل وآخرون. تحدد هيستون H3 ليسين 4 أسيتيل وديناميات مثيلة الأنواع الفرعية لسرطان الثدي. Oncotarget 7, 5094–5109 (2016).

ويلش ، ب.ل. & أمبير كينج ، م. BRCA1 و BRCA2 وعلم الوراثة لسرطان الثدي والمبيض. همم. مول. جينيه. 10, 705–713 (2001).

Li، H. إطار إحصائي لاستدعاء SNP ، واكتشاف الطفرات ، ورسم خرائط الارتباط ، وتقدير المعلمات الجينية السكانية من بيانات التسلسل. المعلوماتية الحيوية 27, 2987–2993 (2011).

لو ، ر. وآخرون. كلير: استكشاف حدود استخدام شبكة عصبية عميقة على بيانات pileup لاستدعاء متغير الخط الجرثومي. ما قبل الطباعة في bioRxiv https://doi.org/10.1101/865782 (2019).

سيمبسون ، جي تي وآخرون. الكشف عن مثيلة السيتوزين DNA باستخدام تسلسل النانو. نات. أساليب 14, 407–410 (2017).

مارتن ، م وآخرون. WhatsHap: مراحل سريعة ودقيقة قائمة على القراءة. ما قبل الطباعة في bioRxiv https://doi.org/10.1101/085050 (2016).

تيت ، جي جي وآخرون. COSMIC: كتالوج الطفرات الجسدية في السرطان. الدقة الأحماض النووية. 47، D941-D947 (2019).

Martignano ، F. et al. مثيلة GSTP1 وتعبير البروتين في سرطان البروستاتا: الآثار التشخيصية. ديس. علامات 2016, 4358292 (2016).

كابير ، إن إن ، رونستراند ، إل & أمبير كازي ، جيه يو كيراتين 19 يرتبط بالتشخيص السيئ لسرطان الثدي. مول. بيول. اعادة عد. 41, 7729–7735 (2014).

Wang ، X.-M. ، Zhang ، Z. ، Pan ، L.-H. ، Cao ، X.-C. & أمبير شياو ، سي. KRT19 و سيكام 5 تشير الخلايا السرطانية المتداولة التي تحمل علامة mRNA إلى تشخيص غير مواتٍ لمرضى سرطان الثدي. الدقة سرطان الثدي. يعامل. 174, 375–385 (2019).

نوجوتشي ، إس وآخرون. الكشف عن الأورام الدقيقة لسرطان الثدي في الغدد الليمفاوية الإبطية عن طريق تفاعل إنزيم المنتسخة العكسية والبوليميراز المتسلسل. مقارنة بين MUC1 مرنا وتضخيم الكيراتين 19 مرنا. أكون. J. باتول. 148, 649–656 (1996).

Sedlazeck ، F. J. et al. الكشف الدقيق عن الاختلافات الهيكلية المعقدة باستخدام التسلسل أحادي الجزيء. نات. أساليب 15, 461–468 (2018).

زوك ، جي إم وآخرون. تسلسل مكثف لسبعة جينومات بشرية لتوصيف المواد المرجعية المرجعية. علوم. البيانات 3, 160025 (2016).

Kolmogorov، M.، Yuan، J.، Lin، Y. & amp Pevzner، P. A. تجميع القراءات الطويلة المعرضة للخطأ باستخدام الرسوم البيانية المتكررة. نات. التكنولوجيا الحيوية. 37, 540–546 (2019).

Vaser ، R. ، Sović ، I. ، Nagarajan ، N. & amp ikić ، M. تجميع جينوم de novo سريع ودقيق من قراءات طويلة غير مصححة. الدقة الجينوم. 27, 737–746 (2017).

Li، H. Minimap2: المحاذاة الزوجية لتتابعات النيوكليوتيدات. المعلوماتية الحيوية 34, 3094–3100 (2018).

تشيسون ، إم جي بي وآخرون. اكتشاف متعدد المنصات للتنوع الهيكلي الذي تم حله في النمط الفرداني في الجينوم البشري. ما قبل الطباعة في bioRxiv https://doi.org/10.1101/193144 (2018).

أودانو ، ب.أ وآخرون. توصيف الأليلات الهيكلية المتغيرة الرئيسية للجينوم البشري. زنزانة 176، 663-675 هـ 19 (2019).

ديكسون ، جيه آر وآخرون. الكشف والتحليل التكاملي للتباين الهيكلي في جينومات السرطان. نات. جينيه. 50, 1388–1398 (2018).

Timp ، W. & amp Feinberg ، A. P. السرطان باعتباره إبيجينوم غير منظم يسمح بميزة النمو الخلوي على حساب المضيف. نات. القس السرطان 13, 497–510 (2013).

جيفاريس ، دي سي وآخرون. الاختلافات الهيكلية العابرة لها تأثيرات قوية على الصفات الكمية والعزلة الإنجابية في الخميرة الانشطارية. نات. كومون. 8, 14061 (2017).

Krueger، F. & amp Andrews، S.R.Bismark: أداة تقويم مرنة ودعوة مثيلة لتطبيقات بيسلفيت-تسلسل. المعلوماتية الحيوية 27, 1571–1572 (2011).

Hansen، K.D، Langmead، B. & amp Irizarry، R. A. BSmooth: من تسلسل الجينوم الكامل بيسلفيت يقرأ إلى المناطق الميثيلية التفاضلية. جينوم بيول. 13، R83 (2012).


تسلسل Nanopore 101 سؤالاً وأمبير

هنا يمكنك العثور على جميع الأسئلة والأجوبة التي تم طرحها أثناء تسلسل نانوبور 101 ندوة عبر الإنترنت.

1. كم مرة يمكنك إعادة استخدام خلية التدفق؟

يوجد بروتوكول غسيل خلية التدفق الذي يمكنك استخدامه بين تشغيل عينة واحدة والعينة (العينات) التالية. اعتمادًا على مدى صرامة غسل خلية التدفق ، رأينا العملاء الذين يستخدمون خلية تدفق تصل إلى خمسة أضعاف خمسة ربما تكون نقطة انطلاق جيدة من حيث ما يمكنك توقعه لعدد المرات التي يمكنك فيها إعادة استخدام خلية التدفق. يمكنك أيضًا تشغيل منصة QC قبل الجري لتقييم عدد المسامات النانوية المتاحة لك قبل بدء الجري. لذلك عندما ترغب في إعادة استخدام خلية التدفق ، يمكنك تقييم ما إذا كان هناك ما يكفي من المسام النانوية النشطة المتاحة قبل أن تبدأ تجربة التسلسل. مجموعة الغسل الخاصة بنا متوفرة في المتجر.

2. ما هو أقصى تركيز للجودة الرديئة للحمض النووي الذي يمكن لمنصة التسلسل ذات الثقوب النانوية أن تتسلسل بحساسية جيدة؟

غالبًا ما نتلقى هذه الأنواع من الأسئلة لأن العملاء يدركون أن ثقب النانو صغير جدًا وبالتالي قد يواجهون مشكلات مع الملوثات التي تسد المسام النانوية. في الواقع ، من الصعب سد ثقب النانو. نحن نوجه عملائنا من خلال تقنيات مراقبة الجودة القياسية للحمض النووي والـ RNA ، والتي ستستخدمها عادةً في البيولوجيا الجزيئية ، حيث إنها قابلة للتطبيق على منصتنا. لذا ، فإن قياس نسب A260 / 280 و A260 / A230 ، واستخدام Bioanalyzer لمراقبة الجودة ، يساعدان في ضمان حصولك على عينات عالية الجودة. هذه هي البروتوكولات الرئيسية التي نوصي بها لعملائنا من أجل أن يكونوا قادرين على التقييم ، "هل هذه عينة جيدة لأخذها في التسلسل أم لا؟"

3. هل هناك تعليمات خاصة بكيفية تخزين خلية التدفق بعد غسلها؟ وكم من الوقت يمكننا تخزين خلية التدفق المعاد استخدامها؟

يتم توفير البروتوكولات والكواشف الخاصة بغسل خلايا التدفق وتخزينها - يرجى مراجعة المتجر للحصول على مجموعة أدوات غسل خلية التدفق ومكتبة البروتوكول في المجتمع لمزيد من المعلومات.

4. كم عدد الجينوم البكتيري الذي يمكنني تسلسله على MinION؟

يعتمد عدد العينات التي يمكنك تشغيلها على خلية تدفق (دعنا نتحدث عن MinION Flow Cell) حقًا على تصميمك التجريبي. لتتمكن من الإجابة على هذا السؤال ، سيعتمد ذلك على حجم الجينوم (الجينات) ، ومستوى التغطية التي تريدها لتلك الجينومات. دعنا نقول فقط من أجل البساطة أننا ننظر إلى خلية تدفق صغيرة واحدة ، ونقوم بترتيب وتوليد حوالي 10 جيجا بايت من البيانات. اعتمادًا على حجم الجينوم الذي تبحث عنه ومستوى التغطية الذي تريده ، يمكنك بعد ذلك تقسيم ذلك إلى 10 جيجا بايت لتتمكن من تحديد عدد العينات التي يمكنك معالجتها في خلية تدفق واحدة . قد تكون في طابور للحصول على أكثر من 10 جيجا بايت من البيانات من خلية التدفق الخاصة بك ، مما يعني أنه يمكنك اختيار التوقف وغسل خلية التدفق وإعادة استخدامها في وقت آخر لإنشاء بيانات إضافية. نقترح إلقاء نظرة على دليل Metagenomics Getting Started في مركز الموارد للحصول على مثال حسابي.

5. ما هو العائد النموذجي لخلية التدفق؟

يعتمد بشكل كبير على جودة الحمض النووي المدخلات. يجب أن تولد خلية تدفق MinION أكثر من 25 جيجا بايت من البيانات ، إذا تم تسلسل الحمض النووي عالي الجودة. يرجى الاطلاع على صفحة مقارنة المنتج لمزيد من المعلومات حول مخرجات خلايا التدفق (https://nanoporetech.com/products/comparison)

6. هل لديكم أي توصيات لبروتوكولات استخراج الحمض النووي؟

سؤال رائع لأنه من الواضح أنه لا يوجد نوع عينة واحد هناك! يوجد قسم كامل في قسم المعرفة بمجتمع Nanopore مخصص لبروتوكولات الاستخراج لعينات بيولوجية مختلفة. سأذكر على وجه التحديد أنه عند إجراء الميتاجينوميات ، عليك أيضًا أن تكون حريصًا جدًا على وجود بروتوكول استخراج "متساوٍ" للغاية ، بحيث يعكس التسلسل محتويات العينة بدقة ، ولا يربك بروتوكول الاستخراج الذي تستخدمه يستخدمون.

7. هل VolTRAX متوفر تجارياً؟

نعم ، VolTRAX متاح في المتجر (https://store.nanoporetech.com).

8. ما هي المجموعة التي يجب أن أستخدمها لإعداد مكتبة DNA مع جهاز VolTRAX؟

تتوفر مجموعات VolTRAX المختلفة في المتجر (https://store.nanoporetech.com) ، وسيتم إصدار المزيد قريبًا.

9. ما الفرق بين خلية التدفق R9.4 وخلية التدفق R10.3؟

يكمن الاختلاف في المسامات النانوية الموجودة في كل خلية تدفق. إن nanopore هو في الأساس بروتين بيولوجي يوجد بشكل طبيعي في البيئة. نقوم بالكثير من الأعمال الهندسية داخليًا لتحسين هذه المسام النانوية للاستخدام في نظامنا ، مما يتيح زيادة الإنتاجية والدقة. R9.4.1 nanopore هو ثقب النانو الحالي واسع الاستخدام. بينما يتحرك الحمض النووي عبر ثقب النانو ، هناك نقطة قرصة - تضييق الثقب ، والذي يسمح لنا بقياس التيار ، وبالتالي تفسير انتقال الجزيء في الوقت الفعلي. في سلسلة R10 ، يوجد برميل أطول ونقطتا ضغط ، مما يتيح قياسين من هذا القبيل. يوفر هذا فوائد لتسلسل البوليمرات المتجانسة - امتدادات من نفس القاعدة عدة مرات. هذه الامتدادات المتجانسة صعبة ، ليس فقط لمنصتنا ، ولكن لجميع منصات التسلسل. لقد وجدنا أن إدخال نقطة القرص الثانية هذه يوفر دقة أفضل لتسلسلات البوليمر المتجانس مما رأين سابقًا مع سلسلة R9.4 ، بدأنا في رؤية تسلسل دقيق للغاية لمسافات البوليمر المتجانس لحوالي عشرة قواعد. R10.3 هو أحدث ثقب نانوي في هذه السلسلة ، ويوفر الدقة العالية لسلسلة R10 مع زيادة الإنتاجية والالتقاط.

10. هل يمكنك إخبارنا بالمزيد عن إنشاء المكتبة باستخدام بروتوكول Cas9؟ وما هي التطبيقات التي يمكن استخدامها؟

بروتوكول التخصيب الخالي من تفاعل البوليميراز المتسلسل Cas9 متاح لمدة عام تقريبًا الآن يمكن عرض البروتوكول في مكتبة البروتوكول في المجتمع. إنه بروتوكول بسيط إلى حد ما يستغرق حوالي ساعتين ، لكننا نجعله أكثر بساطة ، ودمج بعض كواشف الجهات الخارجية التي تحتاجها - سيكون هذا متاحًا قريبًا جدًا كمجموعة كاملة. لدينا عدد قليل من المنشورات ومقاطع الفيديو حول استخدام إثراء Cas9 من مجتمع المستخدمين لدينا والمتاحة عبر الإنترنت في مركز الموارد الخاص بنا.

11. كيف تختلف الدقة خلال السباق؟ هل الدقة مستقرة أم أنها تنخفض أثناء التشغيل ، مثل تقنية تسلسل القراءة القصيرة؟

يمكن لتقنيتنا أن تسلسل الحمض النووي الأصلي مباشرة ليست هناك حاجة للتضخيم أو العمليات الأنزيمية أو التألق أو أي شيء آخر. نحن نقيس فقط التدفق الأيوني عندما تمر الجزيئات عبر المسام. وبسبب هذا ، وحقيقة أنه يمكننا تسلسل الجزيئات الطويلة جدًا في قراءة واحدة ، فإن جودة التسلسل هي نفسها طوال فترة التشغيل التي لا نرى انخفاضًا فيها. عندما يمر جزيء DNA أو RNA عبر ثقب نانوي ، يتم تسلسله بالكامل ، بنفس الدقة في بداية الجزيء ونهايته. لا نعرف أيضًا ما هو الحد الأعلى من حيث طول الجزيء الذي يمكننا تسلسله في قراءة واحدة ، فإن السجل حاليًا يبلغ 2.44 ميجا بايت.

12. هل يمكنك التحدث عن اكتشاف SNP باستخدام تسلسل nanopore؟

هناك العديد من أنواع الخوارزميات المختلفة - سواء من المجتمع أو تلك التي يوفرها فريق تحليل البيانات لدينا من خلال Metrichor. واحدة من هذه هي حزمة برامج Medaka ، والتي تمكن العملاء من أداء مستويات مختلفة من تحليل SNP. نحن قادرون على إجراء اكتشاف SNP - القيام بذلك جنبًا إلى جنب مع استراتيجية الإجماع التي وصفتها سيعطي على الأرجح أعلى مستوى من الدقة ، والقدرة على تحديد أشكال تعدد الأشكال المختلفة داخل الجينوم الذي تبحث عنه. لقد رأينا عددًا قليلاً من المنشورات على مدار الثمانية عشر شهرًا الماضية أو نحو ذلك تُظهر دقة تسلسل النانو لتحديد النيوكلوتايد في الإجماع على تسلسل بعض المنشورات الحديثة جدًا حول تسلسل SARS-CoV-2 والتي تُظهر التوافق التام مع الطرق الأخرى. هذه متوفرة في مركز الموارد على موقعنا الإلكتروني ، كما يمكنك دائمًا التواصل معنا على [email protected]

13. بالنسبة للجينومات القصيرة مثل فيروسات النبات (10 كيلو بايت) ، كم عدد العينات التي يمكنني تعددها باستخدام خلية تدفق واحدة؟

ستنتج خلية التدفق الدائرية حوالي 1 جيجا بايت من البيانات ، وبالتالي ستكون ما يعادل 100000 قراءة بطول 10 كيلو بايت - غالبًا ما يشار إليها باسم "تغطية 100000 X". من المحتمل أن ينتج عن خلية تدفق MinION النموذجية ، حيث يمكنك ترميز ما يصل إلى 24 جينومًا فيروسيًا ، أكثر من 20 جيجا بايت ، أو ما يقرب من 100000 قراءة لكل عينة مشفرة.

14. لكشف الميثيلات غير المتعارف عليها ، يتم تدريب معظم الأدوات على أساس الميثيلات المعروفة. توفر بعض الأدوات مزيدًا من المرونة ولكنها لا تزال تتطلب استخدام عينة ميثلة مخصصة كمرجع لاكتشاف الميثيلات غير المتعارف عليها. هل لدينا أي أدوات لاستخراج الإشارات الشاذة بسهولة ، بافتراض أن هذه الإشارات الشاذة ناتجة عن مثيلة؟

توجد أدوات متعددة لتحديد التغييرات غير المتعارف عليها في الإشارة الكهربائية الخام. هناك عدد من المنشورات والأدوات المتاحة في مركز الموارد والتي استخدمت مثل هذا النهج مثل الذي وصفته. نحن نشجعك أيضًا على الاتصال إذا كانت لديك متطلبات محددة.

15. هل السعر الموجود على موقع الويب الخاص بك هو سعر الباقة المبدئية بالكامل أم سعر استئجار الجهاز؟

إذا كنت تشير إلى MinION ، فإن السعر هو السعر الإجمالي لحزمة Starter ، بما في ذلك MinION ، أو 1000 دولار.

16. في WIMP ، ما هي قواعد البيانات المستخدمة لتصنيف الكائنات الحية الدقيقة؟

يعتمد WIMP على محرك تصنيف أجهزة الطرد المركزي.

17. إذا كانت المنصة محمولة ، فهل هذا يعني أنه يمكننا القيام بالتسلسل عند السفر بالجهاز؟

تم استخدام منظم التسلسل في الفضاء والسيارات والطائرات وحتى على الدراجة! راجع https://twitter.com/ReindertN/status/1235202393467428864

18. ما مدى استقرار خلية تدفق Flongle مع تكرار لخلية تدفق MinION؟

لقد قمنا بتصنيع خلايا تدفق MinION لبضع سنوات حتى الآن. نضمنها لمدة 3 أشهر عند التسليم عند 4 درجات مئوية ، أو شهر واحد في درجة حرارة الغرفة. يجب استخدام خلايا تدفق Flongle في الوقت الحالي في غضون 4 أسابيع من التسليم وفقًا لما يلي: https://store.nanoporetech.com/flongle-flow-cell-pack.html

20. هل من الممكن إجراء تسلسل مباشر للحمض النووي الريبي للنباتات في الحقل؟ ما هي مجموعات الاستخراج ومجموعات مكتبة VolTRAX التي يجب أن أستخدمها؟

نعم ، من الممكن التسلسل مباشرة في الميدان. سيكون لدينا ندوة متابعة أكسفورد نانوبور حول الاستخراج. في غضون ذلك ، لمزيد من المعلومات حول مجموعات VolTRAX المتاحة ، يرجى زيارة قسم نموذج الإعداد في المتجر (https://store.nanoporetech.com).

21. هل يمكن أن تشرح كيف يعمل "التسلسل التكيفي"؟ هل يمكن استخدامه لتسلسل عائلة من الجينات ، على سبيل المثال؟

22. بالنسبة لبروتوكولات VolTRAX مقابل بروتوكولات أكسفورد Nanopore "العملية" ، هل تنتج نفس جودة المكتبات (الطول ، التوزيع.) ، ونفس نتائج التسلسل؟

تُظهر اختباراتنا الداخلية توافقًا كبيرًا ، ولكن VolTRAX يعمل على تحسين إمكانية التكاثر بين المكتبات.


أساليب

عزل النواة من طرف جذر أرابيدوبسيس

البرية من النوع أرابيدوبسيس نمت الشتلات (Col-0) على ألواح 1/2 MS عند 22 درجة مئوية (16 ساعة فاتحة / 8 ساعات مظلمة) لمدة 10 أيام قبل الحصاد. تم قطع منطقة طرف الجذر (5 مم) من الشتلات ونقلها على الفور إلى أنبوب إيبندورف خالٍ من RNase سعة 1.5 مل محفوظ في النيتروجين السائل وتم طحنه إلى مسحوق ناعم بواسطة طرف ماصة 1000 ميكرولتر في الأنبوب. تم بعد ذلك إذابة المسحوق في 300 ميكرولتر من محلول استخلاص بارد مثلج (EB) —0.4 M سكروز ، 10 ملي مولار Tris-HCl pH 8.0 ، 10 ملي MgCl2، 0.2٪ (وزن / حجم) Triton X-100 ، 1 ملي ديثيوثريتول (DTT) ، 1 × مثبط البروتياز (روش) ، 0.4 يو / ميكرولتر مثبط RNase (RNaseOUT ، Thermo Fisher Scientific). يتم استخدام خافض التوتر السطحي غير الأيوني Triton X-100 لتحرير النوى وتجنب التجميع أثناء FACS [62]. بعد الانقلاب اللطيف والانعكاس اللطيف ، تم ترشيح المجانسة من خلال مصفاة خلية 20 ميكرومتر في أنبوب جديد. تمت إضافة 400 ميكرولتر آخر من EB إلى المصفاة لغسل النوى المتبقية. بعد الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية ، 2000ز لمدة 5 دقائق ، تمت إزالة المادة الطافية بعناية لتجنب ملوثات الحمض النووي الريبي من الجزء السيتوبلازمي. تم غسل الحبيبات مرتين عند 4 درجات مئوية ، 2000ز، 5 دقائق مع 1 مل EB ، ثم معلق في 500 ميكرولتر EB. للفرز ، تم تلطيخ النوى بـ 4،6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) وتم تحميلها في مقياس التدفق الخلوي بفوهة 70 ميكرون. تم استخدام مليلتر واحد EB كمخزن مؤقت للجمع. تم فرز ما مجموعه 40.000 نواة بناءً على إشارة DAPI والحجم النووي. لتجنب التجميع ، تم تكوير النوى المصنفة عند 4 درجات مئوية ، 2000ز، 5 دقائق ، ثم أعيد تعليقه في 100 ميكرولتر PBST عازلة (1 × PBS بتركيز منخفض قدره 0.025 ٪ Triton X-100). بعد التحقق من جودة النوى والعد تحت المجهر باستخدام قناة DAPI ، تم نقل 5000 نواة إلى أنبوب جديد مع 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBST وطردها عند 4 درجات مئوية ، 2000ز، 5 دقائق. بعد ذلك ، تم تعليق الحبيبات في محلول PBST 20 ميكرولتر وتم تخفيفه إلى حوالي 1000 نواة / ميكرولتر.

عزل نواة السويداء

تم عزل السويداء كما ورد سابقًا [63 ، 64]. باختصار ، تم وضع 5 بويضات DAP في مرحلة القلب من التطور الجنيني على شريحة تحت مجهر تشريح. تم إطلاق نوى السويداء إلى الشريحة من البذرة عن طريق الضغط اللطيف بعد ثقب بإبرة. تم تعليق النوى في محلول عزل (0.3 M سوربيتول ، 5 ملي مولار MES (درجة الحموضة 5.7) ، 0.4 وحدة / ميكرولتر RNaseOUT) وتم نقلها إلى أنبوب إيبندورف منخفض 1.5 مل بواسطة ماصة 10 ميكرولتر. بعد ذلك ، تم ترشيح النوى المجمعة باستخدام مصفاة خلية 20 ميكرومتر إلى أنبوب جديد ثم غسلها مرتين باستخدام محلول غسيل (EB) عند 4 درجات مئوية ، 2000ز، 5 دقائق لإزالة الحمض النووي الريبي المجاني والملوثات. بعد ذلك ، تم تعليق النوى في محلول PBST سعة 100 ميكرولتر وتم تخفيفه إلى 1000 نواة / ميكرولتر.

بناء مكتبة RNA-seq أحادية النواة لتسلسل Illumina و Nanopore

تم إنشاء المكتبات وفقًا لبروتوكول 10x الجينوم القياسي (دليل مستخدم Single Cell 3 Reagent Kits v2) مع تعديلات لاستيعاب تسلسل Nanopore طويل القراءة. لطرف الجذر ، تعليق النواة من الخطوة السابقة (

5000 نواة) على 10x Genomics ChIP ، وتم إنشاء المكتبات باستخدام مجموعة 10x Chromium Single Cell 3 Solution V2. بالنسبة للسويداء ،

تم تحميل 10000 نواة وإخضاعها لبناء مكتبة. للحصول على (كدنا) كامل الطول ، نقوم بتمديد وقت الاستطالة أثناء تضخيم (كدنا) من دقيقة واحدة إلى دقيقتين. تم استخدام نصف قالب (كدنا) لإنشاء مكتبة Illumina وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة وتسلسلها باستخدام Illumina NavoSeq (قراءة 1: 28 قاعدة + قراءة 2: 150 قاعدة) ، تم استخدام النصف الآخر من القالب لإنشاء مكتبة Nanopore باستخدام Oxford Nanopore LSK- 109 مجموعة ومتسلسلة على خلية تدفق MinION (R9.4.1).

تحليل بيانات نواة واحدة من Illumina

تم تعيين القراءات الأولية للجذر إلى الجينوم المرجعي TAIR10 بواسطة Cell Ranger (v3.1.0) باستخدام المعلمات الافتراضية. يقوم Cell Ranger (الإصدار 3.1.0) فقط بحساب عدد القراءات بدون الإنترونات لاستيعاب النسبة العالية من القراءات المحتوية على intron في مكتباتنا أحادية النواة ، وقمنا بإزالة مناطق intron لكل قراءة وأعدنا محاذاة القراءات إلى الجينوم المرجعي بواسطة Cell Ranger إلى تحديد الرمز الشريطي للنواة ، UMI ، والجين المقابل لكل قراءة (ملف إضافي 1: الشكل S1). لغرض مراقبة الجودة ، تم التخلص من الجينات المعبر عنها في أقل من ثلاث نوى ، وتمت إزالة الخلايا التي تحتوي على أكثر من 2300 أو أقل من 350. تم تحليل مصفوفة وفرة Illumina لاحقًا باستخدام حزمة Scanpy (الإصدار 1.6.0) [65] مع المعلمات الموصى بها للتطبيع ، وتحويل السجل ، والقياس. بعد ذلك ، تم استخدام تحليل المكون الرئيسي وخوارزمية Louvain في مصفوفة الوفرة هذه للتجميع. بعد ذلك ، استخدمنا جينات العلامة لأنواع مختلفة من الخلايا المحددة في بيانات جذر خلية مفردة ضخمة [17] (ملف إضافي 2: الجدول S1) لإضافة تعليق توضيحي على نوع الخلية لكل مجموعة. نحسب أولاً درجة الخلية لكل نوع خلية لجميع الخلايا بناءً على درجة إثراء جين محدد محدد في خلية معينة ، كما هو موضح سابقًا بالطريقة [66]. إذا كانت أعلى درجة تتجاوز الصفر ، يتم تعيين الخلية لنوع الخلية المقابل وإلا يتم تعيينها على أنها غير معروفة (ملف إضافي 1: الشكل S3a). بعد ذلك ، تم شرح كل مجموعة على أنها نوع الخلية ذات أعلى نسبة (ملف إضافي 1: الشكل S3b) ، واستخدمنا الجينات الخاصة بالمرحلة التطورية المحددة في البيانات الجذرية الضخمة أحادية الخلية [17] (ملف إضافي 1: الجدول S1) لمزيد من التعليق التوضيحي للمجموعات التي تستاء من الخلايا غير الشعرية إما كخلايا غير شعر ناضجة أو خلايا غير شعرية مستطيلة (ملف إضافي 1: الشكل S3c).

خمس بيانات متسلسلة من الحمض النووي الريبي أحادية الخلية منشورة سابقًا للبروتوبلاستيد أرابيدوبسيس تم جمع الجذور باستخدام منصة 10x Genomics من قواعد البيانات العامة [11 ، 12 ، 14 ، 15 ، 16]. نستخدم Scanorama [30] لإزالة تأثيرات الدُفعات وحساب درجة المحاذاة بين مجموعات البيانات المختلفة.

بالنسبة لبيانات السويداء ، تمت معالجة قراءات Illumina الخام بواسطة Cell Ranger (الإصدار 5.0.0) باستخدام المعلمة "--include-introns" ، وتم استخدام النوى التي تحتوي على عدد جيني يتراوح بين 400 و 3000 فقط للتحليل اللاحق. بعد التجميع ، استخدمنا الجينات المخصبة للأنسجة التي تم الإبلاغ عنها مسبقًا في مرحلة القلب والتي تم تحديدها من بيانات المصفوفات الدقيقة لعينات التشريح الدقيق لالتقاط الليزر [50 ، 51] لتعيين أنواع الخلايا (ملف إضافي 2: الجدول S2). نستخدم وظيفة "Rank_genes_groups" الخاصة بـ scanpy لإجراء اختبار Wilcoxon واستخدمنا وظيفة "filter_rank_genes_groups" مع "max_out_group_fraction = 0.25" و "min_ fold_change = 1.50" لتحديد الجينات المخصبة بالعنقود. وتم استخدام agriGO v2 [67] لتحليل تخصيب GO.


معلومات الكاتب

ساهم هؤلاء المؤلفون بالتساوي: أوغوزان بيجيك ، مورغان سي لوكاس.

الانتماءات

مركز تنظيم الجينوم (CRG) ، معهد برشلونة للعلوم والتكنولوجيا ، برشلونة ، إسبانيا

أوجوزان بيجيك ، مورغان سي.لوكاس ، ليسزك ب.بريستش ، خوسيه ميغيل راميريز ، ربيكا ميدينا ، إيفان ميلينكوفيتش ، سونيا كروشياني ، هوانلي ليو ، هيلين جراتزييل سانتوس فييرا ، وأمبير إيفا ماريا نوفوا

معهد غارفان للبحوث الطبية ، دارلينج هيرست ، نيو ساوث ويلز ، أستراليا

UNSW Sydney، Kensington، NSW، Australia

أوغوزان بيجيك وأمبير جون إس ماتيك

جامعة بومبيو فابرا (UPF) ، برشلونة ، إسبانيا

مورغان سي لوكاس ، إيفان ميلينكوفيتش ، سونيا كروشياني وأمبير إيفا ماريا نوفوا

المعهد الدولي للبيولوجيا الجزيئية والخلوية ، وارسو ، بولندا

معهد وايزمان للعلوم ، رحوفوت ، إسرائيل

Aldema Sas-Chen & amp Schraga Schwartz

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

مساهمات

أ. و M.C.L. أجرى معظم التجارب المعملية الرطبة ، بما في ذلك استخراج الحمض النووي الريبي وإعداد مكتبة nanopore. أ. و L.P.P. أجرى تحليلًا للمعلومات الحيوية للبيانات ، جنبًا إلى جنب مع J.M.R. و E.M.N. أ. تصميم وتنفيذ تجارب nanoCMC-seq. م. أنتجت التسلسلات المنسوخة في المختبر مع التعديلات ومكتباتها النانوية المقابلة. أ. أعدت وتسلسل المتواليات المكتوبة في المختبر باستخدام مقاييس متكافئة سودوريدين مختلفة. ل. قام بقياس وكتابة كود nanoRMS ، جنبًا إلى جنب مع O.B. و E.M.N. ج. أجرى تحليلات المعلومات الحيوية على التركيبات المنسوخة في المختبر ومقارنة خوارزميات الاستدعاء الأساسي ورسم الخرائط. قامت IM ببناء تدرجات متعددة وساعدت في مكتبات nanopore المقابلة. أعدت S.C. و IM وتسلسل 2′-اسلالات متحولة الميثيل. ر. و H.G.S.V. مثقف S. cerevisiae سلالات تحت ظروف الإجهاد المختلفة. ساهم HL برمز لتحليل قيم الكثافة الحالية. م. و S. م. تصور المشروع. م. أشرف على العمل بمساعدة ش. M.C.L. ، O.B. و E.M.N. بنى التماثيل. OB ، M.C.L. و E.M.N. كتب الورقة ، مع مساهمات من جميع المؤلفين.

المؤلف المراسل


أتاح تسلسل Nanopore جنبًا إلى جنب مع الإثراء المستهدف المستند إلى CRISPR / Cas9 تحديد ملامح SNVs و SVs والمثيلة والمراحل الأليلية للجينات الرئيسية المرتبطة بالسرطان.

اقرأ الطول

تقرأ Nanopores طول الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي المقدم لها - من القصير إلى الطويل جدًا (الأطول> 4 ميجا بايت)

أبعاد

تشمل التطبيقات المناسبة

  • جينومات كاملة / إكسومات
  • Metagenomics
  • التسلسل المستهدف
  • نسخة كاملة (كدنا)
  • نسخ أصغر (RNA مباشر)
  • مضاعفة العينات الأصغر

عائدات مرتفعه

ما يصل إلى 50 جيجابايت لكل خلية تدفق صغيرة / 2.8 جيجابايت لكل خلية تدفق فلونج *

* أقصى خرج نظري عند تشغيل النظام لمدة 72 ساعة (أو 16 ساعة لـ Flongle) عند 420 قاعدة / ثانية. قد تختلف المخرجات وفقًا لنوع المكتبة وظروف التشغيل وما إلى ذلك.

الاتصال

يزن أقل من 100 جرام ويتم توصيله بجهاز كمبيوتر شخصي أو كمبيوتر محمول باستخدام كابل USB 3.0 عالي السرعة

منخفض الكلفة

  • حزم المبتدئين من 1000 دولار بما في ذلك المواد الاستهلاكية
  • متوافق مع Flongle Flow Cells لإجراء اختبارات وتحليلات أصغر
  • مجموعات مضاعفة لإنتاجية أعلى للعينة

اقرأ الطول

تقرأ Nanopores طول الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي المقدم لها - من القصير إلى الطويل جدًا (الأطول> 4 ميجا بايت)

أبعاد

تشمل التطبيقات المناسبة

  • جينومات كاملة / إكسومات
  • Metagenomics
  • التسلسل المستهدف
  • نسخة كاملة (كدنا)
  • نسخ أصغر (RNA مباشر)
  • مضاعفة العينات الأصغر

عائدات مرتفعه

ما يصل إلى 50 جيجابايت لكل خلية تدفق صغيرة / 2.8 جيجابايت لكل خلية تدفق فلونج *

* أقصى خرج نظري عند تشغيل النظام لمدة 72 ساعة (أو 16 ساعة لـ Flongle) عند 420 قاعدة / ثانية. قد تختلف المخرجات وفقًا لنوع المكتبة وظروف التشغيل وما إلى ذلك.


تسلسل Nanopore المستهدف مع Cas9 لدراسات المثيلة والمتغيرات الهيكلية والطفرات

يمكن لتقنية التسلسل النانوي إجراء استجواب سريع ومباشر لجزيئات الحمض النووي الأصلية. غالبًا ما نهتم فقط باستجواب مناطق محددة على عمق عالٍ ، لكن طرق التخصيب التقليدية أثبتت حتى الآن أنها غير مناسبة للقراءات الطويلة 1. الاستراتيجيات الحالية محدودة حاليًا بمتطلبات الحمض النووي عالية المدخلات ، والعائد المنخفض ، والقراءات القصيرة (& lt5kb) ، والبروتوكولات التي تستغرق وقتًا طويلاً ، و / أو التضخيم أو الاستنساخ (فقدان معلومات تعديل القاعدة). في هذا البحث ، نصف تقنية تستخدم قدرة Cas9 على إدخال تخفيضات في مواقع محددة وربط محولات تسلسل الثقوب النانوية مباشرة إلى تلك المواقع ، وهي طريقة نطلق عليها "التسلسل المستهدف لـ Cas9 النانوي" (nCATS).

لقد أظهرنا ذلك باستخدام خلية تدفق Oxford Nanopore MinION (السعة & gt10Gb +) لتوليد تغطية متوسط ​​165X في 10 مواقع جينومية بطول متوسط ​​18 كيلو بايت ، مما يمثل تحسنًا بعدة مئات من المرات على تغطية 2-3X التي تم تحقيقها بدون تخصيب. أجرينا تشغيلًا تجريبيًا على خلية تدفق Flongle الأصغر (سعة

1 جيجا بايت) ، مما ينتج عنه تغطية متوسطة تبلغ 30X في 11 موقعًا جينوميًا بمتوسط ​​طول 18 كيلو بايت. باستخدام لوحات من RNAs الإرشادية ، نظهر أن بيانات التغطية العالية من هذه الطريقة تمكننا من (1) تحديد أنماط مثيلة الحمض النووي في جينات محركات السرطان ، (2) اكتشاف الاختلافات الهيكلية في النقاط الساخنة المعروفة ، و (3) مسح الوجود من طفرات النوكليوتيدات المفردة. يوفر هذا معًا طريقة منخفضة التكلفة يمكن تطبيقها حتى في الأماكن منخفضة الموارد لفحص الحمض النووي الخلوي مباشرةً. هذه التقنية لها تطبيقات سريرية واسعة لتقييم الجينات ذات الصلة طبياً ولديها تعدد الاستخدامات لتكون أداة تشخيصية سريعة وشاملة. نعرض تطبيقات هذه التقنية من خلال فحص خط خلايا GM12878 المميز جيدًا بالإضافة إلى ثلاثة خطوط لخلايا الثدي (MCF-10A ، MCF-7 ، MDA-MB-231) مع إمكانات أورام متفاوتة كنموذج للسرطان.

مساهمات قامت TG و WT ببناء الدراسة. أجرى TG التجارب. حللت TG و IL و FS البيانات. TG و JG و ER و RB و AH وطوروا الطريقة. كتب TG و WT الورقة


ملف إضافي 1:

الشكل S1. مخططات دائرية استنساخ في الأغنام والماشية. الشكل S2. التحقق من صحة SNP عن طريق استنساخ PCR محدد. الشكل S3. التمييز بين النيوكلوتايد الحقيقي والتحف الفنية. الشكل S4. فرط التحولات في طليعة الفيروسات BLV. الشكل S5. التحقق من صحة المتغيرات الهيكلية BLV عن طريق استنساخ PCR محدد. الشكل S6. SNPs وإعادة التركيب في خط خلية HIV-1 U1. الشكل S7. تقدير كفاءة PCIP-seq. الشكل S8. أمثلة على فيروسات HIV-1 الأولية من المريض 02006. الشكل S9. موقع إدخال ERV يسبب نقص الكوليسترول في أبقار هولشتاين. الشكل S10. تم التحقق من صحة BERVK2 عبر PCIP-seq. الشكل S11. تطابق ERV BTA3_115.3 LTRs APOB (BTA11_77.9) ERV. الشكل S12. تم التحقق من صحة enJSRV. الجدول S1. مقارنة PCIP-seq بتسلسل PCR و Illumina بوساطة الربط. الجدول S2. تم تحديد SNPs في كل عينة. الجدول S3. المتغيرات الهيكلية BLV المحددة بواسطة PCIP-seq. الجدول S4. المعلومات السريرية لمرضى HIV-1. الجدول S5. تم تحديد BERVK2s في الماشية بواسطة PCIP-seq. الجدول S6. تم تحديد enJSRVs في الأغنام بواسطة PCIP-seq. الجدول S7. تم تحديد مواقع تكامل فيروس الورم الحليمي البشري في مرضى HPV18_PX و HPV18_PY. الجدول S8. تقدير كفاءة PCIP-seq في BLV. الملاحظة التكميلية 1. الأساس المنطقي لاستخدام CRISPR-cas9 لشق الحمض النووي الدائري. الملاحظة التكميلية 2. تأثير التغطية على مكالمات SNP. الطرق التكميلية. المراجع التكميلية.

ملف إضافي 2:

مجموعة البيانات S1. تم تحديد مواقع تكامل HIV-1 في المرضى 02006 و 06042.


شاهد الفيديو: How is Oxford Nanopore used? WIRED (أغسطس 2022).