معلومة

ما هو أحدث بروتوكول CRISPR / Cas9؟

ما هو أحدث بروتوكول CRISPR / Cas9؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أقوم بجمع الأدبيات لبدء مشروع جديد حول تحرير الجينات CRISPR / Cas9. يجب أن أضع بروتوكولًا للبدء وأعتزم استخدام الورقة التالية كدليل:

"هندسة الجينوم باستخدام نظام CRISPR-Cas9". بروتوكول الطبيعة 8 (11): 2281-308 · نوفمبر 2013

هل يمكنك من فضلك توضيح ما إذا كان هذا هو البروتوكول العام الأكثر موثوقية والأحدث المنشور لنظام CRISPR / Cas9.


يعتمد الأمر حقًا على ما تريد فعله به. التمسك بهندسة الجينوم في الخلايا البشرية ، بروتوكول الطبيعة 8 (11): 2281-308 · نوفمبر 2013 هو المعيار الفعلي. أحد التحسينات التي أقترحها هو استبدال "Surveyor Assay" بتحليل deconvolution لتتبع التسلسل باستخدام TIDE.


العلاج الجيني كريسبر / كاس

مراسلة Baohong Zhang ، قسم علم الأحياء ، جامعة شرق كارولينا ، جرينفيل ، نورث كارولاينا 27858 ، الولايات المتحدة الأمريكية.

قسم الأحياء ، جامعة إيست كارولينا ، جرينفيل ، نورث كارولينا ، الولايات المتحدة الأمريكية

مراسلة Baohong Zhang ، قسم علم الأحياء ، جامعة شرق كارولينا ، جرينفيل ، نورث كارولاينا 27858 ، الولايات المتحدة الأمريكية.

الملخص

متكررات متكررة قصيرة متناوبة متباعدة (CRISPR) / إنزيم (Cas) المرتبط بـ CRISPR هو أداة تحرير الجينوم التي تحدث بشكل طبيعي والتي تم تبنيها من نظام الدفاع المناعي التكيفي بدائية النواة. حاليًا ، أصبح تحرير الجينوم المستند إلى CRISPR / Cas9 أحد أكثر الأدوات الواعدة لعلاج الأمراض الوراثية البشرية ، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية والاضطرابات العصبية والسرطانات. كتعديل سريع لنظام CRISPR / Cas9 ، بما في ذلك نظام التسليم ، تمت دراسة العلاج الجيني المستند إلى CRISPR / Cas9 على نطاق واسع في العلاجات قبل السريرية والعيادة. يعد تحرير الجينوم CRISPR / Cas أيضًا أداة قوية لإنشاء نماذج وراثية حيوانية لدراسة الاضطرابات الوراثية البشرية وعلاجها ، وخاصة الأمراض المرتبطة بالطفرات النقطية. ومع ذلك ، لا تزال هناك تحديات كبيرة أيضًا قبل استخدام تقنية CRISPR / Cas بشكل روتيني في العيادة لعلاج الأمراض الوراثية المختلفة ، والتي تشمل السمية والاستجابة المناعية للخلايا المعالجة لمكون CRISPR / Cas ، وطريقة توصيل عالية الإنتاجية ، وتأثير محتمل خارج الهدف . يعد التأثير غير المستهدف أحد الاهتمامات الرئيسية للعلاج الجيني CRISPR / Cas9 ، يجب أن تركز المزيد من الأبحاث على الحد من هذا التأثير من خلال تصميم جرنا عالي الجودة واستخدام خصوصية عالية من إنزيمات كاس. لا يستهدف تعديل طريقة توصيل CRISPR / Cas9 نسيجًا / خلية معينة فحسب ، بل يحتمل أيضًا أن يحد من التأثير خارج الهدف.


الملخص

تعتبر التشوهات الخلقية السبب الرئيسي لوفيات الأطفال في الولايات المتحدة وأوروبا. نظرًا للتقدم السريع في علم الجينوم البشري ، يمكننا الآن تحديد المتغيرات التسلسلية التي قد تسبب المرض لدى هؤلاء المرضى بكفاءة. ومع ذلك ، لا يزال تحديد السببية للمرض يمثل تحديًا. بالإضافة إلى ذلك ، في حالة أمراض القلب الخلقية ، فإن العديد من الجينات المرشحة المحددة إما جديدة على التطور الجنيني أو ليس لها وظيفة معروفة. لذلك ، هناك حاجة ملحة لتطوير تقنيات غير مكلفة وفعالة لفحص هذه الجينات المرشحة لظاهرة المرض في أنظمة النموذج ولإجراء دراسات وظيفية للكشف عن دورها في التنمية. لهذا الغرض ، سعينا إلى اختبار تحرير الجينات المستند إلى F0 CRISPR كخسارة لاستراتيجية الوظيفة لمرض ظاهري في كائن نموذج الضفدع ، Xenopus Tropicalis. نوضح أن نظام CRISPR / Cas9 يمكنه تعديل كلا الأليلين في جيل F0 بكفاءة في غضون ساعات قليلة بعد الإخصاب ، مع تلخيص حتى الأنماط الظاهرية للمرض المبكرة التي تشبه إلى حد كبير الضربات القاضية من morpholino oligos (MOs) في جميع الحالات التي تم اختبارها تقريبًا. وجدنا أن حقن بروتين Cas9 أكثر فعالية وأقل سمية بشكل كبير من كاس 9 مرنا. نستنتج أن تعديل الجين F0 المستند إلى CRISPR في العاشر الاستوائية يتسم بالكفاءة والفعالية من حيث التكلفة ويعيد تلخيص المرض والأنماط الظاهرية للعضلات المعدنية بسهولة.


مراجع

Porteus، M. تحرير الجينوم: نهج جديد للعلاجات البشرية. Annu. القس فارماكول. توكسيكول. 56, 163–190 (2016).

بورتيوس ، م. نحو عصر جديد في الطب: تحرير الجينوم العلاجي. جينوم بيول. 16, 286 (2015).

نالديني ، ل. السابق فيفو نقل الجينات وتصحيحها للعلاجات القائمة على الخلايا. نات. القس جينيه. 12, 301–315 (2011).

كوكس ، دي بي تي ، بلات ، آر جيه. & amp Zhang، F. تحرير الجينوم العلاجي: الآفاق والتحديات. نات. ميد. 21, 121–131 (2015).

كونغ ، ل. وآخرون. هندسة الجينوم المتعدد باستخدام أنظمة CRISPR / Cas. علم 339, 819–823 (2013).

جينك ، م وآخرون. نوكلياز DNA داخلي قابل للبرمجة مزدوج RNA موجه في المناعة البكتيرية التكيفية. علم 337, 816–821 (2012).

هندل ، إيه وآخرون. تعزز RNAs الدليلة المعدلة كيميائيًا تحرير جينوم CRISPR-Cas في الخلايا الأولية البشرية. نات. التكنولوجيا الحيوية. 33, 985–989 (2015).

أوزبورن ، إم جي وآخرون. تقييم التحرير الجيني TCR الذي تم تحقيقه بواسطة TALENs و CRISPR / Cas9 و megaTAL nucleases. مول. هناك. 24, 570–581 (2016).

شومان ك وآخرون. توليد الخلايا التائية البشرية الأولية باستخدام بروتينات نوكليوبروتينات Cas9. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 112, 10437–10442 (2015).

ديويت ، ماجستير وآخرون. تحرير الجينوم الخالي من الانتقاء للطفرة المنجلية في الخلايا الجذعية المكونة للدم والبالغين. علوم. ترجمة. ميد. 8، 360ra134 (2016).

جندري ، م. وآخرون. تحرير الجينوم عالي الكفاءة للخلايا السلفية المكونة للدم والفئران بواسطة CRISPR / Cas9. مندوب الخلية. 17, 1453–1461 (2016).

بورتيوس ، م. & amp Baltimore، D. تحفز نوكليازات الكيميرية استهداف الجينات في الخلايا البشرية. علم 300, 763 (2003).

Rouet ، P. ، Smih ، F. & amp Jasin ، M. يحفز التعبير عن نوكلياز داخلي خاص بالموقع على إعادة التركيب المتماثل في خلايا الثدييات. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 91, 6064–6068 (1994).

Kass، E.M. & amp Jasin، M. التعاون والمنافسة بين مسارات إصلاح كسر شرائط الحمض النووي المزدوجة. FEBS ليت. 584, 3703–3708 (2010).

ديفر ، د. وآخرون. استهداف جين CRISPR / Cas9 β-globin في الخلايا الجذعية المكونة للدم البشرية. طبيعة سجية 539, 384–389 (2016).

هندل ، إيه وآخرون. قياس نتائج تحرير الجينوم في المواقع الداخلية باستخدام تسلسل SMRT. مندوب الخلية. 7, 293–305 (2014).

برزل ، إيه وآخرون. استهداف الجينات غير المحفز بدون نوكليازات يحسن الهيموفيليا B في الفئران. طبيعة سجية 517, 360–364 (2015).

ميلر ، دي جي ، بيتيك ، إل إم وأمبير راسل ، دي دبليو. يتم تحسين استهداف الجينات البشرية عن طريق ناقلات الفيروسات المرتبطة بالغدة عن طريق فواصل الحمض النووي المزدوجة. مول. زنزانة. بيول. 23, 3550–3557 (2003).

راسل ، د. & amp Hirata، R.K. استهداف الجينات البشرية بالنواقل الفيروسية. نات. جينيه. 18, 325–330 (1998).

Song ، L. et al. نقل عالي الكفاءة للخلايا الجذعية المكونة للدم البشرية الأولية والتعبير المقيد لنسب كرات الدم الحمراء عن طريق نواقل النمط المصلي AAV6 الأمثل في المختبر وفي نموذج xenograft الفئران في الجسم الحي. بلوس واحد 8، e58757 (2013).

وانج ، جيه وآخرون. تحرير الجينوم عالي الكفاءة الذي يحركه التماثل في الخلايا التائية البشرية من خلال الجمع بين نوكلياز إصبع الزنك وإيصال المتبرعين AAV6. الدقة الأحماض النووية. 44، e30 (2016).

سثر ، ب. وآخرون. التعديل الفعال لـ CCR5 في الخلايا المكونة للدم البشرية الأولية باستخدام نوكلياز ضخم ونموذج مانح AAV. علوم. ترجمة. ميد. 7، 307ra156 (2015).

دي رافين ، إس إس وآخرون. إضافة الجينات المستهدفة في الخلايا المكونة للدم CD34 + البشرية لتصحيح مرض الورم الحبيبي المزمن المرتبط بـ X. نات. التكنولوجيا الحيوية. 34, 424–429 (2016).

دي رافين ، إس إس وآخرون. إصلاح الجين CRISPR-Cas9 للخلايا الجذعية المكونة للدم من المرضى الذين يعانون من مرض الورم الحبيبي المزمن المرتبط بـ X. علوم. ترجمة. ميد. 9، aah3480 (2017).

بوم ، سي إم ، وايسمان ، آي إل ، تسوكاموتو ، أ.س. ، بوكلي ، إيه. & amp Peault، B. عزل مجموعة الخلايا الجذعية المكونة للدم البشرية المرشحة. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 89, 2804–2808 (1992).

Doulatov، S.، Notta، F.، Laurenti، E. & amp Dick، J.E. Hematopoiesis: منظور إنساني. الخلية الجذعية للخلايا 10, 120–136 (2012).

Majeti، R.، Park، C.Y. & amp Weissman، I.L. تحديد التسلسل الهرمي للأسلاف المكونة للدم متعددة القدرات في دم الحبل السري البشري. الخلية الجذعية للخلايا 1, 635–645 (2007).

نوتا ، إف وآخرون. عزل الخلايا الجذعية المكونة للدم الفردية القادرة على الانصهار طويل المدى متعدد السلالات. علم 333, 218–221 (2011).

شولتز ، L.D. ، إيشيكاوا ، F. & amp Greiner ، D.L. الفئران المؤنسنة في البحوث الطبية الحيوية متعدية. نات. القس إمونول. 7, 118–130 (2007).

جينوفيز ، ب. وآخرون. تحرير الجينوم المستهدف في إعادة تسكين الخلايا الجذعية المكونة للدم في الإنسان. طبيعة سجية 510, 235–240 (2014).

هوبان ، دكتوراه في الطب وآخرون. تصحيح طفرة مرض الخلايا المنجلية في الخلايا الجذعية المكونة للدم البشرية. دم 125, 2597–2604 (2015).

باك ، R.O. & أمبير ؛ بورتيوس ، M.H. التكامل بوساطة كريسبر لأشرطة الجينات الكبيرة باستخدام نواقل المانحين AAV. مندوب الخلية. 20, 750–756 (2017).

ران ، FA وآخرون. هندسة الجينوم باستخدام نظام CRISPR-Cas9. نات. بروتوك. 8, 2281–2308 (2013).

ران ، FA وآخرون. في الجسم الحي تحرير الجينوم باستخدام المكورات العنقودية الذهبية كاس 9. طبيعة سجية 520, 186–191 (2015).

كلاينستيفر ، ب. وآخرون. نوكليازات CRISPR-Cas9 المهندسة مع خصائص PAM المتغيرة. طبيعة سجية 523, 481–485 (2015).

إليوت ، ب ، ريتشاردسون ، سي ، ويندرباوم ، جيه ، نيكولوف ، ج. & amp Jasin، M. مسارات تحويل الجينات من إصلاح كسر الخيط المزدوج في خلايا الثدييات. مول. زنزانة. بيول. 18, 93–101 (1998).

راغو ، سي ، فوغلشتاين ، بي أند بونز ، إف. الضربات القاضية الجينية والضربة القاضية في الخلايا الجسدية البشرية. نات. بروتوك. 2, 2734–2746 (2007).

خان ، آي إف ، هيراتا ، آر. & amp راسل ، د. طرق استهداف الجينات بوساطة AAV للخلايا البشرية. نات. بروتوك. 6, 482–501 (2011).

هيراتا ، ر. & amp راسل ، د. تصميم وتعبئة نواقل استهداف الجينات الفيروسية المرتبطة بالفيروس. J. فيرول. 74, 4612–4620 (2000).

هوليوود ، جا ، لي ، سي إم ، سكالان ، إم إف. وأمبير هاريسون ، بى تى. تحليل مسارات إصلاح الجينات من فواصل Cas9 / gRNA مزدوجة الشريطة في جين CFTR البشري. علوم. اعادة عد. 6, 32230 (2016).

هوبارد ، ن. وآخرون. يستعيد تحرير الجينات المستهدف وظيفة CD40L المنظمة في متلازمة فرط IgM المرتبطة بـ X. دم 127, 2513–2522 (2016).

جريجر ، جي سي ، تشوي ، ف.دبليو. & amp Samulski ، R.J. إنتاج وتوصيف النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدة. نات. بروتوك. 1, 1412–1428 (2006).

جريجوريفيتش ، ب. وآخرون. التوصيل الجهازي للجينات إلى العضلات المخططة باستخدام النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدة. نات. ميد. 10, 828–834 (2004).

Aurnhammer، C. et al. تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي العالمي لاكتشاف وتحديد تسلسل التكرار الطرفي المقلوب المشتق من النمط المصلي الفيروسي المرتبط بالغدة. همم. الجين هناك. أساليب 23, 18–28 (2012).

لوك ، إم وآخرون. توصيف مادة معيارية مرجعية من النوع 2 المرتبط بالفيروس الغدي المؤتلف. همم. الجين هناك. 21, 1273–1285 (2010).

Park، C.Y.، Majeti، R. & amp Weissman، I.L. في الجسم الحي تقييم تكوين الدم البشري من خلال زرع الأعضاء للخلايا الجذعية المكونة للدم المنقى من دم الحبل السري. نات. بروتوك. 3, 1932–1940 (2008).

Notta ، F. ، Doulatov ، S. & amp Dick ، ​​J.E. Engraftment من الخلايا الجذعية المكونة للدم البشرية أكثر كفاءة في المستلمين الإناث NOD / SCID / IL-2Rgc-null. دم 115, 3704–3707 (2010).

تشيكيبام ، إل ، سودري ، أل ، كورزيو ، بكالوريوس & amp Bonamino، M.H. طريقة فعالة منخفضة التكلفة لنقل الجينات إلى الخلايا اللمفاوية التائية. بلوس واحد 8، e60298 (2013).

دانيت ، GH ، Pan ، Y. ، Luongo ، J.L. ، Bonnet ، D.A. & أمبير سايمون ، م. توسيع الخلايا البشرية SCID - إعادة السكان في ظل ظروف نقص الأكسجة. J. كلين. استثمار. 112, 126–135 (2003).

كولر ، إم آر ، بندر ، جي جي ، بابوتساكيس ، إي تي. & أمبير ميلر ، W.M. آثار توليفات السيتوكينات التآزرية ، وانخفاض الأكسجين ، والسدى المُعرَّض للإشعاع على توسع أسلاف دم الحبل السري البشري. دم 80, 403–411 (1992).

Strober ، W. اختبار استبعاد تريبان الأزرق لصلاحية الخلية. بالعملة. بروتوك. إمونول. الملحق 3 ، الملحق 3 ب http://dx.doi.org/10.1002/0471142735.ima03bs21 (2001).

راينش ، إيه وآخرون. يتيح نموذج زرع أجنبي لنخاع العظم المتوافق مع البشر إمكانية التحصين المحسن للخلايا المكونة للدم البشرية السليمة وسرطان الدم. نات. ميد. 22, 812–821 (2016).

Psaila، B. et al. يحدد التنميط أحادي الخلية من أسلاف خلايا النواء الكريات الحمر البشرية مسارات تمايز خلايا النواء الكبيرة والكريات الحمر. جينوم بيول. 17, 83 (2016).

باك ، R.O. وآخرون. الهندسة الوراثية المتعددة للخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية باستخدام CRISPR / Cas9 و AAV6. إليفي 6، e27873 (2017).


محتويات

الدراسات المبكرة في أنواع معينة انيقة [1] و ذبابة الفاكهة سوداء البطن [2] [3] شهدت شاشات فقدان الوظيفة المنتظمة على نطاق واسع (LOF) التي تم إجراؤها من خلال طفرات التشبع ، مما يدل على إمكانات هذا النهج في توصيف المسارات الوراثية وتحديد الجينات ذات الوظائف الفريدة والأساسية. تم تطبيق تقنية الطفرات في التشبع لاحقًا في الكائنات الحية الأخرى ، على سبيل المثال سمك الزرد [4] [5] والفئران. [6] [7]

ظهرت الأساليب المستهدفة لضربة قاضية للجينات في الثمانينيات من القرن الماضي باستخدام تقنيات مثل إعادة التركيب المتماثل ، [8] [9] الريبوزيمات العابرة للانقسام ، [10] [11] والتقنيات المضادة للحساسية. [12] [13]

بحلول عام 2000 ، ظهرت تقنية تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) كتقنية سريعة وبسيطة وغير مكلفة لضربة قاضية للجينات المستهدفة ، وكانت تُستخدم بشكل روتيني للدراسة في الجسم الحي وظيفة الجين فيها C. ايليجانس. [14] [15] [16] [17] في الواقع ، في غضون بضع سنوات فقط بعد اكتشافه بواسطة Fire وآخرون. (1998) ، [18] تقريبًا كل من

19000 جين في C. ايليجانس تم تحليله باستخدام ضربة قاضية قائمة على RNAi. [19]

سهّل إنتاج مكتبات RNAi تطبيق هذه التقنية على نطاق الجينوم الواسع ، وأصبحت الأساليب القائمة على RNAi هي النهج السائد لشاشات الضربة القاضية على مستوى الجينوم. [ بحاجة لمصدر ]

ومع ذلك ، فإن الأساليب القائمة على RNAi لشاشات ضربة قاضية على مستوى الجينوم لها حدودها. أولاً ، تسبب التأثيرات العالية خارج الهدف مشكلات في الملاحظات الإيجابية الزائفة. [20] [21] بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا لأن RNAi يقلل من التعبير الجيني في مستوى ما بعد النسخ عن طريق استهداف RNA ، فإن الشاشات القائمة على RNAi تؤدي فقط إلى قمع جزئي وقصير المدى للجينات. في حين أن الضربة القاضية الجزئية قد تكون مرغوبة في مواقف معينة ، إلا أن هناك حاجة إلى تقنية ذات كفاءة استهداف محسنة وتأثيرات أقل خارج الهدف. [ بحاجة لمصدر ]

منذ التعرف الأولي على أنه جهاز مناعي تكيفي بدائي النواة ، [22] أصبح النوع الثاني من البكتيريا المتجمعة بانتظام متناظرة قصيرة (CRISPR) / نظام Cas9 أداة بسيطة وفعالة لتوليد طفرات LOF المستهدفة. [23] تم تطبيقه بنجاح لتحرير الجينوم البشري ، وبدأ في إزاحة RNAi كأداة مهيمنة في دراسات الثدييات. [24] في سياق شاشات خروج المغلوب على مستوى الجينوم ، أظهرت الدراسات الحديثة أن شاشات CRISPR / Cas9 قادرة على تحقيق استنفاد كامل للبروتين بكفاءة عالية ، والتغلب على المشكلات غير المستهدفة التي تظهر مع شاشات RNAi. [25] [26] باختصار ، أدى ظهور CRISPR-Cas9 مؤخرًا إلى زيادة قدرتنا بشكل كبير على أداء شاشات LOF واسعة النطاق. إن تعدد الاستخدامات وقابلية البرمجة في Cas9 ، إلى جانب الضوضاء المنخفضة والكفاءة العالية بالضربة القاضية والحد الأدنى من التأثيرات غير المستهدفة ، جعلت من CRISPR النظام الأساسي المفضل للعديد من الباحثين المشاركين في استهداف الجينات وتحريرها. [24] [27]

CRISPR / Cas9 فقدان وظيفة التحرير

نظام التكرارات المتناظرة القصيرة المُجمَّعة بانتظام (CRISPR) / نظام Cas9 عبارة عن تقنية لتحرير الجينات يمكنها تقديم فواصل مزدوجة الشرائط (DSBs) في موضع جينومي مستهدف. باستخدام دليل واحد RNA (sgRNA) ، يمكن توصيل نوكلياز Cas9 الداخلي إلى تسلسل DNA محدد حيث يشق سلسلة النيوكليوتيدات. [28] يتم تحديد خصوصية sgRNA من خلال تسلسل 20-nt ، متماثل مع موضع الاهتمام الجيني ، ويتم التوسط في الارتباط بـ Cas9 بواسطة منطقة سقالة ثابتة من sgRNA. يجب أن يتبع الموقع الهدف المطلوب على الفور (5 "إلى 3") بواسطة شكل مجاور محفوظ لـ 3 نيوكليوتيدات بروتوسفاسر (PAM). [29] [30] من أجل إصلاح DSBs ، قد تستخدم الخلية الانضمام غير المتماثل المعرض للخطأ بدرجة عالية ، أو إعادة التركيب المتماثل. من خلال تصميم sgRNAs المناسبة ، يمكن إدخال عمليات الإدراج أو الحذف المخطط لها في الجينوم. في سياق شاشات LOF على مستوى الجينوم ، فإن الهدف هو التسبب في تعطيل الجينات والضربة القاضية. [ بحاجة لمصدر ]

تحرير مكتبات sgRNA

إنشاء مكتبة التحرير

لإجراء عمليات الضربة القاضية لـ CRISPR على نطاق الجينوم ، يجب إنشاء مجموعات من sgRNAs المعروفة باسم مكتبات sgRNA ، أو مكتبات خروج المغلوب CRISPR. تتمثل الخطوة الأولى في إنشاء مكتبة sgRNA في تحديد المناطق الجينومية ذات الأهمية بناءً على قواعد استهداف sgRNA المعروفة. [31] على سبيل المثال ، تكون sgRNAs أكثر فاعلية عند استهداف مناطق ترميز الجينات وليس UTRs 5 و 3. تمثل exons المحفوظة أهدافًا جذابة ، ويجب مراعاة الموضع المتعلق بموقع بدء النسخ. [31] ثانيًا ، تم تحديد واختيار جميع مواقع حزب الأصالة والمعاصرة الممكنة. [31] يجب تحليل النشاط داخل وخارج الهدف ، وكذلك محتوى GC ، ويجب تجنب امتدادات البوليمر المتجانس. [31] نوكلياز Cas9 الداخلي الأكثر استخدامًا ، مشتق من الأبراج العقدية، يتعرف على تسلسل PAM من NGG. [32]

علاوة على ذلك ، يبدو أن النيوكليوتيدات المحددة مفضلة في مواقع محددة. يُفضل الجوانين بشدة على السيتوزين في الموضع 20 بجوار نموذج PAM مباشرةً ، وفي الموضع 16 يُفضل السيتوزين على الجوانين. [33] بالنسبة للنيوكليوتيدات المتغيرة في شكل NGG PAM ، فقد تبين أن السيتوزين مفضل وأن الثايمين غير مرغوب فيه. [33] مع أخذ هذه المعايير في الاعتبار ، تم تصميم مكتبة sgRNA حسابيا حول مواقع PAM المختارة. [31] [33] [34]

يجب إنشاء sgRNAs متعددة (على الأقل 4-6) ضد كل جين واحد للحد من الكشف الإيجابي الكاذب ، ويجب تضمين sgRNAs الضابطة السلبية مع عدم وجود أهداف معروفة. [31] [33] ثم يتم إنشاء sgRNAs بواسطة فى الموقع التوليف ، تضخيمه بواسطة PCR ، واستنساخه في نظام توصيل ناقل.

تحرير المكتبات الموجودة

يعد تطوير مكتبة sgRNA جديدة عملية شاقة وتستغرق وقتًا طويلاً. في الممارسة العملية ، يمكن للباحثين اختيار مكتبة موجودة بناءً على الغرض التجريبي وخطوط الخلايا التي تهمهم. اعتبارًا من فبراير 2020 ، كانت أكثر الموارد المستخدمة على نطاق واسع لشاشات خروج المغلوب CRISPR على مستوى الجينوم هي مكتبتي Genome-Scale CRISPR Knock-Out (GeCKO) التي أنشأها مختبر Zhang. [35] تتوفر من خلال addgene ، وتستهدف هذه المكتبات lentiviral على التوالي exons الإنسان والفأر ، وكلاهما متاح كنظام متجه واحد (حيث توجد sgRNAs و Cas9 على نفس البلازميد) أو كنظام ثنائي الاتجاه (حيث توجد sgRNAs و Cas9 على بلازميدات منفصلة). يتم تسليم كل مكتبة على شكل مكتبتين نصفيتين ، مما يسمح للباحثين بفحص 3 أو 6 sgRNAs / جين. [36]

بصرف النظر عن GeCKO ، تم إنشاء عدد من مكتبات CRISPR الأخرى وإتاحتها من خلال addgene. تحتوي مختبرات Sabatini & amp Lander حاليًا على 7 مكتبات بشرية وفأرية منفصلة ، بما في ذلك مكتبات فرعية مستهدفة للوحدات الفرعية المتميزة مثل كينازات وجينات الريبوسوم (Addgene # 51043–51048). علاوة على ذلك ، أدت التحسينات التي أدخلت على خصوصية sgRNAs إلى مكتبات "الجيل الثاني" ، مثل مكتبات Brie (Addgene # 73632) و Brunello (Addgene # 73178) التي تم إنشاؤها بواسطة مختبرات Doench and Root ، ومكتبة Toronto (TKO) (Addgene # 1000000069) تم إنشاؤه بواسطة مختبر موفات. [36]

ناقلات Lentiviral تحرير

يتطلب خروج الجينات المستهدفة باستخدام CRISPR / Cas9 استخدام نظام توصيل لإدخال sgRNA و Cas9 في الخلية. على الرغم من إمكانية توفر عدد من أنظمة التوصيل المختلفة لـ CRISPR ، [37] [38] يتم تنفيذ شاشات فقدان الوظيفة على مستوى الجينوم في الغالب باستخدام نواقل الفيروس البطيئة من الجيل الثالث. [35] [39] [40] هذه النواقل الفيروسية البطيئة قادرة على نقل مجموعة واسعة من أنواع الخلايا بكفاءة والاندماج بشكل ثابت في جينوم الخلايا المنقسمة وغير المنقسمة. [41] [42] يتم إنتاج جسيمات الجيل الثالث من الفيروس البطيء عن طريق العدوى المشتركة لخلايا الكلى الجنينية البشرية (HEK) 293T مع:

  1. اثنان من البلازميدات للتغليف ، أحدهما ترميز Rev والآخر Gag و Pol
  2. مغلف بلازميد قابل للتبديل يشفر مغلفًا لبروتين سكري لفيروس آخر (الأكثر شيوعًا بروتين G لفيروس التهاب الفم الحويصلي (VSV-G))
  3. واحد أو اثنان (اعتمادًا على المكتبة المطبقة) يقوم بنقل البلازميدات ، والترميز لـ Cas9 و sgRNA ، بالإضافة إلى علامات التحديد. [35] [43] [44]

يتم حصاد المادة الطافية المحتوية على جسيمات الفيروسة البطيئة وتركيزها واستخدامها لاحقًا لإصابة الخلايا المستهدفة. [45] سيختلف البروتوكول الدقيق لإنتاج الفيروس البطيء اعتمادًا على هدف البحث والمكتبة التطبيقية. [35] [43] [44] إذا تم استخدام نظامين متجهين ، على سبيل المثال ، يتم نقل الخلايا بالتتابع باستخدام Cas9 و sgRNA في إجراء من خطوتين. [35] [44] على الرغم من أن هذا الأمر أكثر تعقيدًا ، إلا أنه يتميز بوجود عيار أعلى لفيروس مكتبة sgRNA. [35]

تحديد النمط الظاهري تحرير

بشكل عام ، هناك تنسيقان مختلفان لشاشات خروج المغلوب CRISPR على مستوى الجينوم: مصفوفة ومجمعة. في شاشة مرتبة ، تحتوي كل بئر على سجرنا محدد ومعروف يستهدف جينًا معينًا. [46] نظرًا لأن sgRNA المسؤول عن كل نمط ظاهري معروف بناءً على موقع البئر ، يمكن تحديد الأنماط الظاهرية وتحليلها دون الحاجة إلى التسلسل الجيني. يسمح هذا التنسيق بقياس أنماط ظاهرية خلوية أكثر تحديدًا ، ربما عن طريق التألق أو التألق ، ويسمح للباحثين باستخدام المزيد من أنواع المكتبات وطرق التسليم. [46] بالنسبة لشاشات LOF واسعة النطاق ، تعتبر التنسيقات المصفوفة منخفضة الكفاءة ومكلفة من حيث الموارد المالية والمادية لأنه يجب عزل مجموعات الخلايا وتربيتها بشكل فردي. [46]

في شاشة مجمعة ، يتم نقل الخلايا المزروعة في وعاء واحد بكميات كبيرة مع نواقل فيروسية تحتوي بشكل جماعي على مكتبة sgRNA بأكملها. للتأكد من أن كمية الخلايا المصابة بأكثر من جسيم واحد يحتوي على sgRNA محدود ، يتم استخدام تعدد منخفض للعدوى (MOI) (عادة 0.3-0.6). [46] [47] اقترحت الأدلة حتى الآن أنه يجب تمثيل كل sgRNA في 200 خلية على الأقل. [48] ​​[23] سيتم اختيار الخلايا المتحولة ، متبوعًا بالاختيار الإيجابي أو السلبي للنمط الظاهري المطلوب ، وسيكون التسلسل الجيني ضروريًا لتحديد الحمض النووي الريبي المتكامل. [46]

تسلسل الجيل التالي وتحرير تحليل ضربات الأمبير

بعد اختيار النمط الظاهري ، يتم استخراج الحمض النووي الجيني من الحيوانات المستنسخة المحددة ، جنبًا إلى جنب مع مجموعة خلايا التحكم. [23] [46] [49] في البروتوكولات الأكثر شيوعًا للضربة القاضية على مستوى الجينوم ، يتم إنشاء "مكتبة تسلسل الجيل التالي (NGS)" من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل المكون من خطوتين (PCR). [23] [46] تعمل الخطوة الأولى على تضخيم منطقة sgRNA ، باستخدام بادئات خاصة بتسلسل تكامل الفيروسة البطيئة ، والخطوة الثانية تضيف متواليات Illumina i5 و i7. [23] تسمح NGS لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل بتحديد sgRNAs المسترجعة ، ويمكن استخدام خطوة القياس الكمي لتحديد الوفرة النسبية لكل sgRNA. [23]

تتمثل الخطوة الأخيرة في الشاشة في التقييم الحسابي لـ sgRNAs المخصب أو المستنفد بشكل كبير ، وتتبعها مرة أخرى إلى الجينات المقابلة لها ، وبالتالي تحديد الجينات والمسارات التي يمكن أن تكون مسؤولة عن النمط الظاهري المرصود. تتوفر حاليًا العديد من الخوارزميات لهذا الغرض ، وأكثرها شيوعًا هو التحليل المستند إلى النموذج لطريقة CRISPR / Cas9 Knockout (MAGeCK) على مستوى الجينوم. [50] تم تطويره خصيصًا لشاشات خروج المغلوب CRISPR / Cas9 في عام 2014 ، أظهر MAGeCK أداءً أفضل مقارنة بالخوارزميات البديلة في ذلك الوقت ، [50] ومنذ ذلك الحين أظهر نتائج قوية وحساسية عالية عبر ظروف تجريبية مختلفة. [51] اعتبارًا من عام 2015 ، تم توسيع خوارزمية MAGeCK لإدخال قياسات مراقبة الجودة ، وحساب كفاءة خروج المغلوب لـ sgRNA التي تم التغاضي عنها سابقًا. [51] تم أيضًا دمج أداة التصور على شبكة الإنترنت (VISPR) ، مما يسمح للمستخدمين باستكشاف النتائج والتحليل وضوابط الجودة بشكل تفاعلي. [51]

آليات الإشارات الخلوية

على مدار السنوات الأخيرة ، ظهرت شاشة CRISPR على مستوى الجينوم كأداة قوية لدراسة الشبكات المعقدة للإشارات الخلوية. [52] الإشارات الخلوية ضرورية لعدد من العمليات البيولوجية الأساسية ، بما في ذلك نمو الخلايا ، وتكاثرها ، وتمايزها ، وموت الخلايا المبرمج.

أحد الأمثلة العملية هو تحديد الجينات المطلوبة للإشارات التكاثرية في الخلايا السرطانية. يتم نقل الخلايا بمكتبة CRISPR sgRNA ، ودراستها للنمو بمرور الوقت. من خلال مقارنة وفرة sgRNA في الخلايا المختارة بعنصر تحكم ، يمكن للمرء تحديد أي sgRNAs أصبحت مستنفدة وبالتالي الجينات التي قد تكون مسؤولة عن عيب الانتشار. تم استخدام هذه الشاشات لتحديد الجينات الأساسية للسرطان في ابيضاض الدم النخاعي الحاد [53] والورم الأرومي العصبي ، [54] ولوصف الاختلافات الخاصة بالورم بين خطوط الخلايا السرطانية. [55]

تحديد الشركاء القاتلين الاصطناعية تحرير

تم تصميم علاجات السرطان الموجهة لاستهداف جينات أو بروتينات أو بيئات معينة تساهم في نمو خلايا الورم أو بقائها على قيد الحياة. ومع ذلك ، بعد فترة من العلاج المطول بهذه العلاجات ، قد تتطور مقاومة الخلايا السرطانية. على الرغم من أن الآليات الكامنة وراء مقاومة أدوية السرطان غير مفهومة جيدًا ، إلا أن الأسباب المحتملة تشمل: التغيير المستهدف ، وتدهور الأدوية ، وهروب موت الخلايا المبرمج ، والتعديلات اللاجينية. [56] المقاومة معروفة جيدًا وتشكل مشكلة خطيرة في إدارة السرطان. [ بحاجة لمصدر ]

للتغلب على هذه المشكلة ، يمكن تحديد شريك قاتل اصطناعي. يمكن استخدام شاشات LOF على مستوى الجينوم باستخدام CRISPR-Cas9 للكشف عن الشركاء القاتلين الاصطناعي. [57] لهذا الغرض ، يتم نقل خط خلية من النوع البري وخط خلية سرطانية يحتوي على الطفرة المسببة للمقاومة باستخدام مكتبة CRISPR sgRNA. يتم زراعة خطي الخلايا ، ويتم تحليل أي خلايا ناقصة التمثيل أو ميتة لتحديد الجينات الشريكة الاصطناعية المميتة المحتملة. دراسة حديثة أجراها هينز وآخرون. (2019) [58] استخدم هذه الطريقة لتحديد التفاعل المميت الاصطناعي بين عقار العلاج الكيميائي الأسباراجيناز وجينين في مسار إشارات Wnt NKD2 و LGR6.

عوامل تبعية المضيف للعدوى الفيروسية

بسبب الجينومات الصغيرة والعدد المحدود للبروتينات المشفرة ، تستغل الفيروسات بروتينات المضيف للدخول والتكرار والانتقال. إن تحديد مثل هذه البروتينات المضيفة ، والتي يطلق عليها أيضًا عوامل اعتماد المضيف (HDFs) ، مهم بشكل خاص لتحديد الأهداف العلاجية. على مدى السنوات الأخيرة ، نجحت العديد من المجموعات في استخدام تقنية CRISPR / Cas9 على مستوى الجينوم كاستراتيجية فحص لـ HDFs في حالات العدوى الفيروسية. [59]

قدم مارسو أحد الأمثلة وآخرون. (2017) ، [60] الذي يهدف إلى تشريح العوامل المضيفة المرتبطة بعدوى حمى الضنك والتهاب الكبد الوبائي سي (اثنان من الفيروسات في الأسرة فلافيفيريدي). تم العثور على ELAVL1 ، وهو بروتين مرتبط بـ RNA تم ترميزه بواسطة جين ELAVL1 ، ليكون مستقبلًا حاسمًا لدخول HCV ، وتم توضيح اختلاف ملحوظ في عوامل اعتماد المضيف بين فلافيفيريدي. [60]

مزيد من التطبيقات تحرير

تشمل التطبيقات الإضافية التي تم الإبلاغ عنها لشاشات كريسبر على مستوى الجينوم دراسة: استقلاب الميتوكوندريا ، [61] مقاومة البكتيريا للسموم ، [62] العوامل الوراثية للورم الخبيث ، [63] مقاومة أدوية السرطان ، [64] موت الخلايا الناجم عن فيروس غرب النيل ، [65] وشبكات جينات الخلايا المناعية. [66] [67]

سيتناول هذا القسم على وجه التحديد شاشات CRISPR على مستوى الجينوم. لمراجعة قيود كريسبر ، انظر Lino et al. (2018) [38]

تحرير مكتبة sgRNA

سيتم تقييد شاشات CRISPR على مستوى الجينوم في النهاية بخصائص مكتبة sgRNA المختارة. ستحتوي كل مكتبة على مجموعة مختلفة من sgRNAs ، وقد يختلف متوسط ​​التغطية لكل جين. تميل المكتبات المتاحة حاليًا إلى أن تكون متحيزة نحو sgRNAs التي تستهدف إكسونات ترميز البروتين المبكرة (5 بوصات) ، بدلاً من تلك التي تستهدف مجالات البروتين الأكثر وظيفية. [58] سلط هينز الضوء على هذه المشكلة وآخرون. (2019) ، [58] الذي أشار إلى أن الجينات المرتبطة بحساسية الأسباراجيناز فشلت في تسجيل نقاط في شاشة الجينوم الواسعة لخلايا سرطان الدم المقاومة للأسباراجيناز.

في حالة عدم توفر مكتبة مناسبة ، فإن إنشاء مكتبة sgRNA جديدة وتضخيمها يعد عملية طويلة قد تستغرق عدة أشهر. تشمل التحديات المحتملة ما يلي: (1) تصميم فعال لـ sgRNA (2) ضمان تغطية شاملة لـ sgRNA في جميع أنحاء الجينوم (3) تصميم العمود الفقري للنواقل الفيروسية (4) إنتاج كميات كافية من الفيروس البطيء عالي الجودة (v) التغلب على كفاءة التحول المنخفضة (6) التحجيم المناسب من الثقافة البكتيرية. [68]

الحفاظ على تغطية sgRNA الخلوية تحرير

تتمثل إحدى أكبر العقبات أمام فحص CRISPR على مستوى الجينوم في ضمان التغطية الكافية لمكتبة sgRNA عبر مجموعة الخلايا. [23] وقد اقترحت الأدلة حتى الآن أنه يجب تمثيل كل sgRNA والحفاظ عليها في 200-300 خلية على الأقل. [23] [48]

مع الأخذ في الاعتبار أن البروتوكول القياسي يستخدم عدوى عدوى

0.3 ، وكفاءة تحويل 30-40٪ [44] [23] يصبح عدد الخلايا المطلوبة لإنتاج والحفاظ على تغطية مناسبة كبيرًا جدًا. على سبيل المثال ، أكثر مكتبات sgRNA البشرية شيوعًا هي مكتبة GeCKO v2 التي أنشأها مختبر Zhang [30] وتحتوي على 123،411 sgRNAs. عادةً ما تنقل الدراسات التي تستخدم هذه المكتبة أكثر من 1 × 10 8 خلايا [58] [59] [69]

مع استمرار CRISPR في إظهار ضوضاء منخفضة وتأثيرات قليلة خارج الهدف ، تتمثل الإستراتيجية البديلة في تقليل عدد sgRNAs لكل جين للشاشة الأولية. يتم استخدام عمليات قطع أقل صرامة لاختيار النتائج ، ويتم استخدام sgRNAs الإضافية لاحقًا في شاشة ثانوية أكثر تحديدًا. تم توضيح هذا النهج بواسطة Doench وآخرون. (2016) ، [33] الذي وجد أن & gt92٪ من الجينات التي تم استردادها باستخدام البروتوكول القياسي تم استردادها أيضًا باستخدام عدد أقل من sgRNAs لكل جين. يقترحون أن هذه الاستراتيجية يمكن أن تكون مفيدة في الدراسات التي يكون فيها التوسع باهظ التكلفة. [ بحاجة لمصدر ]

القيود Lentiviral تحرير

نواقل الفيروسة البطيئة لها قيود عامة معينة. أولاً ، من المستحيل التحكم في مكان اندماج الجينوم الفيروسي في جينوم المضيف ، وقد يؤثر ذلك على وظائف مهمة للخلية. فانوتشي وآخرون. [70] يقدم مراجعة ممتازة للنواقل الفيروسية جنبًا إلى جنب مع مزاياها وعيوبها العامة. في السياق المحدد لشاشات CRISPR على مستوى الجينوم ، فإن إنتاج وتحويل جزيئات الفيروسة البطيئة أمر شاق نسبيًا ويستغرق وقتًا طويلاً ، ويستغرق حوالي أسبوعين إجمالاً. [44] بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا لأن الحمض النووي يندمج في جينوم المضيف ، فإن توصيل الفيروس البطيء يؤدي إلى تعبير طويل الأمد لـ Cas9 ، مما قد يؤدي إلى تأثيرات خارج الهدف. [ بحاجة لمصدر ]

تحرير الشاشات المصفوفة مقابل المجمعة

في شاشة مرتبة ، تحتوي كل بئر على سجرنا محدد ومعروف يستهدف جينًا معينًا. لذلك ، تسمح الشاشات المصفوفة بالتوصيف التفصيلي لخلية واحدة ، ولكنها محدودة بسبب التكاليف المرتفعة والعمالة المطلوبة لعزل وثقافة العدد الكبير من مجموعات الخلايا الفردية. [46] شاشات CRISPR المجمعة التقليدية بسيطة نسبيًا وفعالة من حيث التكلفة ، ولكنها محدودة بدراسة مجموعة الخلايا بأكملها. هذا يعني أنه قد يكون من الصعب تحديد الطرز المظهرية النادرة ، ويمكن فقط اختيار الأنماط الظاهرية الخام على سبيل المثال. بقاء الخلية أو انتشارها أو التعبير الجيني للمراسل. [ بحاجة لمصدر ]

وسائل الإعلام الثقافية تحرير

قد يؤثر اختيار وسط المزرعة على الأهمية الفسيولوجية للنتائج من تجارب زراعة الخلايا بسبب الاختلافات في تكوين المغذيات وتركيزاتها. [71] تم مؤخرًا عرض تحيز منهجي في مجموعات البيانات الناتجة لشاشات إسكات الجينات CRISPR و RNAi (خاصة للجينات الأيضية) ، [72] وللتوصيف الأيضي لخطوط الخلايا السرطانية. [71] على سبيل المثال ، تم العثور على اعتماد أقوى على ASNS (مركب الأسباراجين) في سلالات الخلايا المزروعة في DMEM ، والتي تفتقر إلى الأسباراجين ، مقارنة بخطوط الخلايا المزروعة في RPMI أو F12 (المحتوية على الأسباراجين). [72] تجنب مثل هذا التحيز يمكن تحقيقه باستخدام وسائط موحدة لجميع خطوط الخلايا التي تم فحصها ، وبشكل مثالي ، باستخدام وسط نمو يمثل المستويات الفسيولوجية للمغذيات بشكل أفضل. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير أنواع من الوسائط ، مثل Plasmax [73] و Human Plasma Like Medium (HPLM) ، [74].

كريسبر + تحرير تسلسل الحمض النووي الريبي أحادية الخلية

تهدف التقنيات الناشئة إلى الجمع بين شاشات CRISPR المجمعة والدقة التفصيلية لتسلسل RNA أحادي الخلية المتوازي بشكل كبير (RNA-seq). أظهرت الدراسات التي تستخدم "CRISP-seq" ، [75] "CROP-seq" ، [76] و "PERTURB-seq" [77] قراءات جينية غنية ، تحدد بدقة توقيعات التعبير الجيني لعمليات الضربة القاضية للجينات الفردية في مجموعة معقدة من الخلايا . تتمتع هذه الطرق بفائدة إضافية تتمثل في إنتاج ملفات تعريف نسخية للخلايا التي يسببها sgRNA. [ بحاجة لمصدر ]


بروتوكولات لتحرير جينوم كريسبر في نظامك النموذجي

تبحث عن بروتوكولات تحرير الجينوم كريسبر؟ اقرأ عن مكتبتنا المتنامية من البروتوكولات وأساليب المستخدم - قد يكون لدينا ما تحتاجه للبدء. وإذا كان لديك بروتوكول جديد لاستخدام Alt-R CRISPR RNA و / أو نوكليازات ، فتعرف على كيفية مشاركته مع مجتمع البحث.

يتوسع البحث في التطبيقات التي تستخدم أنظمة CRISPR-Cas لتحرير الجينوم بسرعة. يمثل هذا حاجة إلى كواشف وبروتوكولات فعالة لمجموعة متنوعة من الأنظمة النموذجية التي تتجاوز الخلايا المستزرعة في الثدييات.

مزايا Alt-R CRISPR RNAs والبروتينات لتحرير الجينوم

كريسبر دليل RNAs. استخدم Alt-R CRISPR RNAs لتوجيه تحرير الجينوم الفعال على الهدف. These length-optimized RNAs are chemically synthesized, which allows addition of modifications for increased nuclease resistance and reduced innate immune responses.

CRISPR proteins. Choose from several recombinant variants of Cas9 (الأبراج العقدية), as well as Cpf1 (Acidaminococcus sp. BV3L6) endonucleases. Alt-R S.p. Cas9 Nuclease 3NLS is suitable for most genome editing studies. Some experiments may benefit from use of Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease, a high-fidelity nuclease that has been engineered to reduce off-target effects while retaining the on-target potency of wild-type Cas9. Alt-R A.s. Cpf1 Nuclease 2NLS provides additional genome editing target sites, because it recognizes an AT-rich protospacer adjacent motif (PAM) rather than the CG-rich Cas9 PAM sequence.

If you are interested in knock-in experiments or other applications requiring homology-directed repair (HDR), consider using an Alt-R Cas9 nickase to create single-strand breaks. Use of a nickase variant with a pair of guide RNAs reduces off-target effects by requiring specific binding of 2 ribonucleoproteins (RNPs), and promotes homology-directed repair, in part, by creating overhanging DNA breaks. However, you will need 2 potent CRISPR target sites at an appropriate distance from your HDR target site.

Alt-R CRISPR RNPs. While the Alt-R CRISPR RNAs are compatible with CRISPR proteins from any source (e.g., cells that stably express CRISPR protein, or CRISPR proteins expressed from DNA or mRNA constructs), we recommend delivery of CRISPR reagents as RNPs by lipofection (e.g., Figure 1), electroporation, or microinjection. Cas9 RNPs are compatible with all 3 methods however, for Cpf1 RNPs, we recommend electroporation and microinjection delivery methods.

Advantages of using Alt-R RNPs include:

  • Efficient, on-target genome editing
  • Precise control of editing complex delivery&mdashcells will not contain templates that express unregulated levels of CRISPR RNAs or endonucleases
  • Lower activation of cellular immune responses and, therefore, reduced toxicity&mdashtoxicity is often observed when using في المختبر transcribed Cas9 mRNA or single guide RNAs (sgRNA)

Protocols and starting points are increasingly available

IDT scientists have developed detailed lipofection and electroporation protocols for using the Alt-R CRISPR-Cas9 System and the Alt-R CRISPR-Cpf1 System in mammalian cells (Table 1). With help from our collaborators, we also make user-submitted methods available for genome editing in other model systems. These protocols and methods are a good starting point for protocol optimization for your studies, and often offer tips for all aspects of genome editing experiments, from growth conditions through genome editing detection.


Accurate evaluation of CRISPR genome editing

Credit: Unsplash/CC0 Public Domain

CRISPR technology allows researchers to edit genomes by altering DNA sequences and by thus modifying gene function. Its many potential applications include correcting genetic defects, treating and preventing the spread of diseases and improving crops.

Genome editing tools, such as the CRISPR-Cas9 technology, can be engineered to make extremely well-defined alterations to the intended target on a chromosome where a particular gene or functional element is located. However, one potential complication is that CRISPR editing may lead to other, unintended, genomic changes. These are known as off-target activity. When targeting several sites in the genome, off-target activity can lead to translocations, unusual rearrangement of chromosomes, as well as other unintended genomic modifications.

Controlling off-target editing activity is one of the central challenges in making CRISPR-Cas9 technology accurate and applicable in medical practice. Current measurement assays and data analysis methods for quantifying off-target activity do not provide statistical evaluation, are not sufficiently sensitive in separating signal from noise in experiments with low editing rates, and require cumbersome efforts to address the detection of translocations.

In the May 24th issue of the journal اتصالات الطبيعة, a multidisciplinary team of researchers from the Interdisciplinary Center Herzliya and Bar-Ilan University report the development of a new software tool to detect, evaluate and quantify off-target editing activity, including adverse translocation events that can cause cancer. The software is based on input taken from a standard measurement assay, involving multiplexed PCR amplification and Next-Generation Sequencing (NGS).

Known as CRISPECTOR, the tool analyzes next generation sequencing data obtained from CRISPR-Cas9 experiments, and applies statistical modeling to determine and quantify editing activity. CRISPECTOR accurately measures off-target activity at every interrogated locus. It further enables better false-negative rates in sites with weak, yet significant off-target activity. Importantly, one of the novel features of CRISPECTOR is its ability to detect adverse translocation events occurring in an editing experiment.

"In genome editing, especially for clinical applications, it is critical to identify low level off-target activity and adverse translocation events. Even a small number of cells with carcinogenic potential, when transplanted into a patient in the context of gene therapy, can have detrimental consequences in terms of cancer pathogenesis. As part of treatment protocols, it is therefore important to detect these potential events in advance," says Dr. Ayal Hendel, of Bar-Ilan University's Mina and Everard Goodman Faculty of Life Sciences.

Dr. Hendel led the study, together with Prof. Zohar Yakhini of the Arazi School of Computer Science at Interdisciplinary Center (IDC) Herzliya. "CRISPECTOR provides an effective method to characterize and quantify potential CRISPR-induced errors, thereby significantly improving the safety of future clinical use of genome editing." Hendel's team used CRISPR-Cas9 technology to edit genes in stem cells relevant to disorders of the blood and the immune system. In the process of analyzing the data, they became aware of the shortcomings of the existing tools for quantifying off-target activity and of gaps that should be bridged to improve applicability. This experience led to the collaboration with Prof Yakhini's leading computational biology and bioinformatics group.

Prof. Zohar Yakhini, of IDC Herzliya and the Technion, says, "In experiments utilizing deep-sequencing techniques that have significant levels of background noise, low levels of true off-target activity can get lost under the noise. The need for a measurement approach and related data analysis that are capable of seeing beyond the noise, as well as of detecting adverse translocation events occurring in an editing experiment, is evident to genome editing scientists and practitioners. CRISPECTOR is a tool that can sift through the background noise to identify and quantify true off-target signals. Moreover, using statistical modeling and careful analysis of the data, CRISPECTOR can also identify a wider spectrum of genomic aberrations. By characterizing and quantifying potential CRISPR-induced errors our methods will support the safer clinical use of genome editing therapeutic approaches."


New, rapid CRISPR/Cas9 method identifies key genes in zebrafish spinal cord regeneration

A new, rapid screening approach uses CRISPR/Cas9 technology to identify immune system-related genes that play a crucial role in repairing zebrafish spinal cord injuries. Marcus Keatinge and Themistoklis Tsarouchas of the University of Edinburgh, U.K., and colleagues present these findings in the open-access journal PLOS Genetics.

In humans and other mammals, severed spinal-cord nerve connections do not heal, so a spinal cord injury may lead to permanent paralysis. In contrast, zebrafish are capable of recovering from spinal cord injury in a process that involves inflammation controlled by macrophages -- a type of immune system cell. However, the precise process by which macrophages aid spinal cord regeneration in zebrafish remains mysterious.

To help clarify this process, Keatinge, Tsarouchas and colleagues developed a new method for rapidly identifying macrophage-related genes that are involved in zebrafish spinal cord regeneration. The strategy employs CRISPR/Cas9 technology, which enables researchers to target and disrupt specific genes, thereby revealing their function. Molecules known as synthetic RNA Oligo CRISPR guide RNAs (sCrRNAs) enable this gene-specific targeting.

The researchers applied the new method to study spinal cord regeneration in larval zebrafish. Key to the method was a prescreening step in which they tested over 350 sCrRNAs that target genes already known to potentially play an important role in inflammation-related spinal cord regeneration. Introducing these sCrRNAs to the zebrafish enabled identification 10 genes that, when disrupted, impaired recovery from spinal cord injury.

Further analysis narrowed the list to four genes that appear to be crucial for repair of severed spinal nerve connections, validating the novel method. One gene in particular, tgfb1, appears to play an essential signaling role in controlling inflammation during the recovery process.

The new method and findings could help deepen understanding of spinal cord regeneration in zebrafish. The researchers also say the method could be adapted to screen for genes that play important roles in other biological processes, as well.

The authors add, "Zebrafish can fully regenerate their spinal cords after injury. Using a new and very rapid screening platform, we discover genes of the immune system that are essential for regeneration. We envision our findings to lead to new insights into the inability of mammals to regenerate and our versatile screening platform to be adapted to other disease or injury models in zebrafish."


معهد واسع

The ability to precisely edit the genome of a living cell holds enormous potential to accelerate life science research, improve biotechnology, and even treat human disease.

Methods for genome editing — primarily zinc finger nucleases and Transcription Activator-Like Effector (TALE) Nucleases — have existed for several years, but in 2013 these were quickly eclipsed by the efficiency, effectiveness and precision of the engineered CRISPR-Cas9 system that was first harnessed for mammalian genome editing by Feng Zhang of the Broad Institute and MIT.

The CRISPR system

Like zinc fingers and TALEs, CRISPR systems are natural products. However, CRISPR-Cas differs from zinc fingers and TALEs in one crucial aspect that makes it superior for genome editing applications: whereas zinc fingers and TALEs bind to DNA through a direct protein-DNA interaction, requiring the protein to be redesigned for each new target DNA site, CRISPR-Cas achieves target specificity through a small RNA that can easily be swapped for other RNAs targeting new sites.

In nature, CRISPR-Cas systems help bacteria defend against attacking viruses (known as bacteriophage or just phage). They consist of two components, the CRISPR (clustered, regularly interspaced palindromic repeats) array and Cas (CRISPR-associated) proteins. CRISPR sequences bookend short stretches of DNA that bacteria have copied from invading phages, preserving a memory of the viruses that have attacked them in the past. These sequences are then transcribed into short RNAs that guide Cas proteins to matching viral sequences. The Cas proteins destroy the matching viral DNA by cutting it. There are a number of different types of CRISPR-Cas systems in nature, which vary in their components the CRISPR-Cas9 system uses just a single protein, Cas9, to find and destroy target DNA. In 2015, Zhang and colleagues successfully harnessed a second system, called CRISPR-Cpf1, which has the potential for even simpler and more precise genome engineering.

Engineering the CRISPR toolbox

In early 2011, Feng Zhang was just starting his own research group at the Broad Institute and MIT, where he is an investigator at the McGovern Institute for Brain Research and a faculty member in the departments of Brain and Cognitive Sciences and Biological Engineering. After learning about existing CRISPR research at a scientific meeting at the Broad, he quickly realized that the system, with a single RNA-guided protein, could be a game changer in genome editing technology. He was already working on DNA targeting methods, having helped to develop the TALE system as a Junior Fellow at Harvard. This system could target and activate genes in mammalian genomes.

Zhang and his team focused on harnessing CRISPR-Cas9 for use in human cells. In January 2013, he reported the first successful demonstration of Cas9-based genome editing in human cells in what has become the most-cited CRISPR paper (Cong et al., Science, 2013). Researchers from George Church’s lab at Harvard University reported similar findings in the same issue of Science (Mali et al., Science, 2013). The Zhang and Church papers showed that Cas9 could be targeted to a specific location in the human genome and cut the DNA there. The cut DNA was then repaired by inserting a new stretch of DNA, supplied by the researchers, essentially achieving “find and replace” functionality in the human genome.

In September, 2015, Zhang and partners described a different system, Cpf1, which appears to have significant implications for research and therapeutics. The Cpf1 system is simpler in that it requires only a single RNA. The Cpf1 enzyme is also smaller than the standard SpCas9, making it easier to deliver into cells and tissues.

Refining and sharing CRISPR tools

The CRISPR toolbox is continuing to expand rapidly, opening new avenues for biomedical research. Since the first publications in early 2013, the Zhang lab and other researchers have engineered a number of improvements to the system. For example, Cas9 has been modified so that instead of cutting the target DNA, it can turn gene expression on by recruiting transcriptional activators to its genomic location (Konermann, et al., Nature, 2014).

At the Broad Institute, the system has also been used for genome-wide screens to identify genes involved in resistance to cancer drugs and dissect immune regulatory networks. CRISPR has been used to rapidly create mouse models of cancer that arise from multiple gene alterations (Platt et al., Cell, 2014). In 2015, Zhang and his team reported success with Cas9 derived from a different bacterium, Staphylococcus aureus (SaCas9). SaCas9 is smaller than the original Cas9, which has advantages for gene therapy (Ran et al., Nature, 2015).

The Zhang lab has trained thousands of researchers in the use of CRISPR-Cas9 genome editing technology through direct education and by sharing more than 40,000 CRISPR-Cas9 components with academic laboratories around the world to help accelerate global research that will benefit human health. In September 2015, the Zhang lab also began to share Cpf1 components.

Users can obtain guide sequences for knock-outs and transcriptional activation as well as information about genome-wide libraries for CRISPR-based screening. The Zhang lab plasmids can be obtained via Addgene, a non-profit plasmid repository dedicated to improving life science research. Additional information about materials can be found on the Zhang laboratory website.


Transfect, enrich, screen, and publish—using our GeneArt CRISPR Nuclease Vector Kit. The CRISPR Nuclease system offers a ready-to-use, all-in-one expression vector system with a Cas9 nuclease expression cassette and a guide RNA cloning cassette for fast cloning of a target-specific crRNA. This system allows you to edit and engineer the genomic locus of your choice in a sequence-specific manner from a single plasmid. After relevant targets have been identified with GeneArt CRISPRs, the biologically-relevant mutations can be validated with GeneArt TALs to reduce potential off-targeting.

GeneArt CRISPR Nuclease Vector Kits are reporter vector systems for expression of the functional components needed for CRISPR-Cas genome editing. The kits make it easy to express noncoding guide RNA (including crRNA and tracrRNA), using a plasmid vector that also expresses Cas9 endonuclease.

The GeneArt CRISPR Nuclease Vector with OFP (orange fluorescent protein) for flow cytometry–based sorting of crRNA-expressing cell populations, whereas GeneArt CRISPR Nuclease Vector with CD4 enables bead-based enrichment of crRNA-expressing cells.

GeneArt CRISPR Nuclease Vectors. (أ) GeneArt CRISPR Nuclease: OFP Reporter Plasmid map and features of GeneArt CRISPR Nuclease: OFP Reporter. The vector is supplied linearized between nucleotides 6,732 and 6,752, with 5 bp 5´ overhangs on each strand as indicated. (ب) GeneArt CRISPR Nuclease: CD4 Enrichment Plasmid map and features of GeneArt CRISPR Nuclease: CD4 Enrichment. The vector is supplied linearized between nucleotides 7,336 and 7,355, with 5 bp 5´ overhangs on each strand as indicated. The linearized GeneArt CRISPR Nuclease Vectors provide a rapid and efficient way to clone double-stranded oligonucleotides encoding a crRNA representing a desired target into an expression cassette that allows sequence-specific targeting of the Cas9 nuclease.

Related products

Try Invitrogen TrueTag Donor DNA Kits can help you obtain up-to 100% knocked in cells using our predesigned and validated donor DNA templates.

Looking for our premium genome editing solutions?

يتعلم أكثر

Once DNA fragments coding for CRISPR-Cas9 system components are cloned, the vector can be propagated within بكتريا قولونية cells to generate sufficient quantities of your expression plasmid. We offer a variety of competent بكتريا قولونية cells, selection of which depends upon the transformation method, and throughput of your experiment.

There are different methods to verify that your plasmid construct is correct, i.e. PCR, restriction digestion or sequencing. The choice depends on whether you are interested in determining if the plasmid contains your DNA insert, is the insert in the right orientation, or does the insert have the correct sequence. We provide molecular biology tools to implement any analysis method you may choose.



تعليقات:

  1. Stockwell

    انها الحقيقة.

  2. Kobi

    يا له من محاورين جيدا :)

  3. Cohen

    نحن لا نرى أي مصير.



اكتب رسالة