معلومة

تحليل المصب بعد العامل الممرض في الجسم الحي RNAseq

تحليل المصب بعد العامل الممرض في الجسم الحي RNAseq



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أجرينا RNA-Seq لعينات بكتيرية في الجسم الحي وحددنا بعض المسارات الرئيسية المنظمة لأعلى ولأسفل.

قارنا البكتيريا أثناء الإصابة بلوحة أجار التقليدية.

ما هي الخطوات التالية للتحقق من صحة النتائج التي توصلنا إليها؟ نحن مهتمون بتطوير المضادات الحيوية واللقاحات.


حسنًا ، أولاً ، أود أن أقول لكل شخص يخطط لتجربة عالية الإنتاجية: الفرضية أولاً ، من ثم تجربة. وإلا فإنك تقوم بإعداد اختبار مكلف ويستغرق وقتًا طويلاً ولن يجيب على الأسئلة التي تريد الإجابة عليها.

في هذه الحالة ، فإن السؤال الذي صُممت تجربتك للإجابة عليه هو "ما الجينات الحاسمة للنمو في الجسم الحي والتي ليست حاسمة للنمو على الصفيحة؟" ، وهو على الأرجح ليس أوضح نموذج لتصميم اللقاح / المضادات الحيوية.

أعتقد أنه يمكنك القول أن الاختلاف بين عينة اللوحة وعينة الجسم الحي هو وجود مضيف ، وبالتالي من الممكن أن تمثل المسارات المنتظمة التكيف المضيف للبكتيريا ، وربما يمكنك مهاجمة البكتيريا من خلال مهاجمة قدرتها على الاستعمار المضيف. يمكن للجين المتورط في التهرب المناعي أن يصنع هدفًا جيدًا.

(هذا نموذج فوضوي للغاية ، حيث توجد العديد من الاختلافات الأخرى ، ولكن نظرًا لأنك أجريت التجربة بالفعل ، فمن المحتمل أن يكون أفضل ما لديك.)

إذن ، استخدم بياناتك لجولة جديدة من إنشاء الفرضيات. خذ مساراتك وتوصل إلى طريقة قد تسمح للبكتيريا بالتكيف مع المضيف - ربما مسار إفرازي يمكن أن يتداخل مع جهاز المناعة المستهدف ، أو بعض جزيئات إشارات الغشاء التي يتم تنظيمها ، أو أيا كان.

الآن لديك فرضية ، لذا صمم تجربة. على سبيل المثال ، خذ عضوًا منظمًا رئيسيًا في المسار. الفرضية هي أنه من الضروري النمو في مضيف ولكن ليس النمو بشكل عام. لذا ، قم بإسقاطها ، إما باستخدام مثبطات كيميائية أو مع التحرير الجيني ، ومعرفة ما إذا كانت أقل فعالية في استعمار المضيف.

(على الرغم من صعوبة قياس فعالية استعمار المضيف بشكل أخلاقي إذا كان الكائن المستهدف هو البشر. ولكن لديك نوعًا من النظام الوكيل أو النموذج لقياس ذلك ، أليس كذلك؟)


تسلسل الحمض النووي الريبي: من التكنولوجيا إلى علم الأحياء

يتم الآن استغلال تقنيات التسلسل من الجيل التالي ليس فقط لتحليل الجينوم الثابت ، ولكن أيضًا النسخ الديناميكية في نهج يسمى RNA-seq. على الرغم من أن هذه التقنيات القوية والمتطورة بسرعة لم تكن متاحة إلا لبضع سنوات ، إلا أنها تقدم بالفعل مساهمات كبيرة في فهمنا لتعبير الجينوم وتنظيمه. هنا ، نصف بإيجاز المشكلات الفنية المصاحبة لتوليد بيانات RNA-seq وتحليلها ، مع إبراز الاختلافات في النهج القائمة على المصفوفة. ثم نراجع البصيرة البيولوجية الحديثة المكتسبة من تطبيق RNA-seq والنهج ذات الصلة لأخذ عينات عميقة من النسخ في أنواع الخلايا المختلفة أو الظروف الفسيولوجية. توفر هذه الأساليب معلومات رائعة حول تنظيم الجينات النسخية وما بعد النسخ ، كما أنها تعطي نظرة ثاقبة فريدة حول ثراء هياكل النسخ والمعالجة على نطاق عالمي وبدقة غير مسبوقة.


مقدمة

تقيس تجارب النسخ النصية التواقيع النسخية الأساسية المسؤولة عن الأنماط الظاهرية المرصودة [1،2،3]. من خلال تقييم ملامح mRNA ، من الممكن استجواب العمليات الجينية المحددة الكامنة وراء أنماط ظاهرية معينة ذات أهمية ، والتي تؤدي إلى ظهورها. لقد توسع استخدام النسخ من أجل تقييم ملف النسخ النسخي لمجموعات الحمض النووي الريبي الأخرى [4] ، مثل الرنا الريباسي [5] ، والميرنا [6 ، 7 ، 8] ، الحمض الريبي النووي النقال [9 ، 10] ، والرناوات الصغيرة الأخرى [11 ، 12] ، 13 ، 14]. عادة ما تحدد تحليلات النسخ التقليدية التعديلات النسخية في كائن حي واحد. ومع ذلك ، غالبًا ما تتضمن العمليات البيولوجية تفاعلات كائنات متعددة ، واستجواب ملف تعريف النسخ لكائن حي واحد فقط لنظام متعدد الكائنات غير كافٍ لفهم النظام البيولوجي بشكل كامل. هذا مهم بشكل خاص في سياق تفاعلات المضيف والممرض ، حيث يمكن أن تساعد النظرة الشاملة للنظام البيولوجي في فهم النظام بشكل أفضل بطرق لتوفير التغيير ، مثل تطوير علاجات علاجية جديدة. ولكنه مهم أيضًا في دراسة أنظمة التعايش الداخلي للمضيف. لمعالجة هذا الأمر ، طور الباحثون طرقًا لاستجواب نسخة الكائنات الحية المتعددة من عينة واحدة. تستخدم دراسات النسخ ثنائية النوع أو دراسات تسلسل الحمض النووي الريبي المزدوجة علم النسخ لتقييم الملامح النسخية لكائنات متعددة نشأت من نفس العينة [15].

تم استخدام أول دراسات النسخ ثنائية النوع لتحليل التفاعلات بين الكائنات حقيقية النواة والكائنات بدائية النواة في أنظمة المضيف الممرض [16 ، 17 ، 18 ، 19]. ومع ذلك ، مقارنة بدراسات النسخ النموذجية ، فإن دراسات النسخ ثنائية النوع تمثل تحديًا تقنيًا بسبب الاختلاف في نسبة القراءات من الكائنات الحية الرئيسية والثانوية في النظام ، حيث يشير الرئيسي والثانوي إلى وفرة النسخ. الكائنات الحية المدروسة في تجارب النسخ ثنائية الأنواع موجودة في وفرة نسبية مختلفة ، وبينما تختلف نسب القراءة بين الكائنين حسب النظام ، فإن معظم نماذج العدوى ، ولا سيما النماذج ذات الصلة بيولوجيًا ، تحتوي على إجمالي محتوى الحمض النووي الريبي للمضيف يفوق عددًا كبيرًا من الميكروب [15 ]. في الحالات التي يكون فيها عدد الخلايا الميكروبية أكثر محدودية ، تكون هناك حاجة إلى طرق الإثراء لاشتقاق عدد ذي مغزى من القراءات من الكائن الحي الثانوي لتحليلات قوية إحصائيًا. مع تحسن أساليب إثراء المكتبات ، توسعت دراسات النسخ ثنائية الأنواع لتشمل دراسة أنظمة حقيقيات النوى وحقيقيات النوى. كمثال ، تم استخدام النسخ ثنائية الأنواع لدراسة التفاعلات الفطرية مع العديد من الثدييات والنباتات [20،21،22،23،24،25]. في أنظمة بدائيات النوى بدائيات النوى ، تم استخدام النسخ ثنائية الأنواع لدراسة الملامح النسخية في تفاعلات الأغشية الحيوية بدائية النواة [26]. في الآونة الأخيرة ، تم إجراء تجارب نسخ متعددة الأنواع لفحص تفاعلات البكتيريا وحقيقيات النوى وحقيقيات النوى في نظام ناقل داخلي للطفيل [27]. مع هذا التعقيد المتزايد ، هناك حاجة إلى أفضل الممارسات لتصميم وإجراء تحليل التعبير التفاضلي بشكل صحيح داخل تجربة نسخ متعددة الأنواع.

هنا ، نصف أفضل الممارسات لتجارب النسخ متعددة الأنواع من التصميم التجريبي الأولي إلى تحليل التعبير التفاضلي المصب ، مع تسليط الضوء على الاعتبارات المهمة التي يجب مراعاتها لتحليلات الأنواع المتعددة هذه عند مقارنتها بتحليلات النسخ التقليدية للأنواع الفردية. بينما نلاحظ المجموعات والأدوات المتاحة حاليًا لكل خطوة من خطوات التحليل ، فإن هدفنا هنا ليس تقديم قائمة شاملة بالأدوات لكل مهمة ولا تحديد أفضل أداة. على غرار الدراسات السابقة لأفضل ممارسات النسخ [28 ، 29] ، يتمثل هدفنا في توفير دليل لإجراء دراسة نسخ متعددة الأنواع من البداية إلى النهاية مع إبراز الاعتبارات الخاصة بدراسات النسخ متعددة الأنواع.


3 نتائج

3.1 توليد مجموعات البيانات المحاكاة

قمنا بمحاكاة مجموعات بيانات RNA-seq مزدوجة للتحقيق في ما إذا كان يمكن استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي المزدوج في أنظمة المضيف الممرض التي تكون فيها الموارد الجينومية محدودة. تمثل مجموعات البيانات المحاكاة مزيجًا عامليًا لطول القراءة (76 نقطة أساس مقابل 150 نقطة أساس) ، وتكوين التسلسل (مزدوج أو منفرد) ، و 12 نسبة مختلفة من قراءات المضيف لقراءات الممرض. في المجموع ، تمت محاكاة 48 مجموعة بيانات RNA-seq مزدوجة ، لكل منها 10 ملايين قراءة. وبالمثل ، قمنا بمحاكاة مجموعات بيانات RNA-seq المزدوجة لـ الانسان العاقل و المبيضات البيض ، و الانسان العاقل و الإشريكية القولونية، أيضًا بنسب متفاوتة من العوامل الممرضة تقرأ لقراءات المضيف. سنناقش أولاً النتائج الرئيسية من الطرف الواحد 76 نقطة أساس A. thaliana و S. octosporus مجموعات البيانات التي تحيل الامتدادات والنتائج المساعدة إلى الملحق.

3.2 مقارنة تخطيط القراءة الأولية

قمنا أولاً بتقييم دقة محاذاة قراءات RNA-seq الخام المزدوجة باستخدام محاذاة مختلفة ، تمثل مقطعًا عرضيًا لخوارزميات المحاذاة ، عند استخدام الجينوم المستهدف الصحيح. عند تعيين القراءات الأولية على الجينوم المستهدف للعامل الممرض محل الاهتمام ، كان للمحاذاة الأربعة معدلات رسم خرائط قابلة للمقارنة للقراءات الناشئة عن العامل الممرض (الشكل 2 أ). محاذاة TopHat2 و MapSplice2 ج. 88٪ من الممرض يقرأ STAR و NextGenMap كل منهما محاذاة أكثر من 99٪ من الممرض يقرأ إلى المرجع الهدف. لم يتأثر معدل رسم خرائط قراءات الممرض بنسبة قراءات الممرض في مجموعات البيانات المتسلسلة. في حين أن STAR و NextGenMap حققا معدل رسم خرائط مرتفعًا لقراءات الممرض ، فإن كلا المحاذاة أيضًا يقرأ مضيفًا خاطئًا على جينوم الأنواع المسببة للأمراض المستهدفة (الشكل 2 ب ، S3). بالنسبة لمحاذاة STAR و NextGenMap لمجموعات البيانات التي كان يوجد فيها عدد أكبر من قراءات المضيف أكثر مما تقرأه العوامل الممرضة ، وهو أمر شائع بين مجموعات بيانات RNA-seq المزدوجة الحقيقية ، تتألف قراءات المضيف غير المحددة من 25-98٪ من إجمالي القراءات المعينة. باختصار ، تمت محاذاة معظم قراءات مسببات الأمراض من تجربة RNA-seq المزدوجة بواسطة محاذاة مشتركة ، لكن المحاذاة التي حددت معظم العوامل الممرضة تقرأ إلى جينوم العامل الممرض المصدر أيضًا بشكل غير صحيح محاذاة معظم قراءات المضيف إلى جينوم الممرض.

نظرًا لأن العديد من الأنواع الممرضة لا تملك موارد جينومية ، فقد بحثنا في كيفية أداء كل من المصففات الأربعة عند رسم الخرائط يقرأ جينوم نوع مرتبط ارتباطًا وثيقًا بالعامل الممرض. كان أداء TopHat2 و MapSplice2 ضعيفًا ، ورسم الخرائط و 0.5٪ من العوامل الممرضة تقرأ عند رسم الخرائط لأي جينوم من الأنواع ذات الصلة. تمكنت STAR و NextGenMap من تعيين قراءات مسببات الأمراض عند استخدام المعلومات الجينومية للأنواع ذات الصلة كمرجع (الشكل 2 أ). ظلت معدلات رسم خرائط قراءات الممرض غير متأثرة بنسبة قراءات العامل الممرض في مجموعات البيانات المتسلسلة. عند استخدام STAR ، ج. 36٪ من القراءات الممرضة تم تعيينها على جينوم S. كريوفيلوس، الأنواع الأكثر ارتباطًا بالأنواع المستهدفة ، S. octosporus. 19٪ من قراءات مسببات الأمراض تعيينها إلى S. japonicus الجينوم ، و 3٪ تعيينه إلى S. بومبي الجينوم (الشكل 2 أ). عند استخدام NextGenMap ، ج. 60 ٪ من قراءات الممرض تعيينها إلى S. كريوفيلوس transcriptome ، تم تعيين 22٪ إلى ملف S. بومبي transcriptome و 28٪ معينًا إلى ملف S. japonicus نسخة (الشكل 2 أ). لكل من STAR و NextGenMap ، انخفضت النسبة المئوية لقراءات الممرض المعينة بشكل عام مع زيادة المسافة التطورية بين الجينوم الهدف والجينوم المرجعي. وبالتالي ، هناك تشعب واضح بين المحاذاة التي يمكنها ولا يمكنها رسم خريطة فعالة لقراءة العامل الممرض عندما يتوفر فقط جينوم مرجعي ذي صلة.

بالنسبة إلى STAR و NextGenMap ، يقرأ المضيف التعيين إلى الجينوم غير الصحيح مع زيادة المسافة التطورية بين أنواع مسببات الأمراض المستهدفة والأنواع المرجعية ، بينما قام TopHat2 و MapSplice2 بتعيين عدد قليل من قراءات المضيف (بحد أقصى 19 قراءة) إلى أي من شيزوساكارومايسيس الجينومات المرجعية تحت أي معلمات التسلسل (الشكل 2 ب ، S3). عند المحاذاة مع STAR ، ج. تم تعيين 21٪ من قراءات المضيف إلى S. كريوفيلوس و S. بومبي الجينوم. على الرغم من أن ج فقط. تم تعيين 1٪ من قراءات المضيف إلى S. بومبي الجينوم ، تم تعيين 3٪ فقط من قراءات الممرض لنفس الجينوم ، لذلك كان معدل رسم الخرائط الإجمالي منخفضًا جدًا. عند المحاذاة مع NextGenMap ، ج. تم تعيين 25٪ من قراءات المضيف إلى ملف S. كريوفيلوس و S. japonicus النسخ ، و ج. تم تعيين 15٪ من قراءات المضيف إلى S. بومبي. تكون تأثيرات التخطي التطوري المرتبط بالمسافة أكبر في مجموعات البيانات التي كانت فيها نسبة قراءة مسببات الأمراض منخفضة ، حيث تشتمل قراءات المضيف على غالبية القراءات الإجمالية المعينة.

3.3 عدد الجينات وتحليل التعبير التفاضلي

للتحقيق في كيفية تأثر البصيرة البيولوجية من خلال رسم خرائط قراءة المضيف ، قمنا بقياس التعداد الجيني للمضيف يقرأ أن STAR تم تعيينه على جينوم العامل الممرض المستهدف. مجموعة البيانات المتسلسلة التي نتج عنها أكبر عدد من قراءات المضيف معطلة لجينوم العامل الممرض المستهدف حيث كان أكبر عدد من قراءات المضيف معطلة هو مجموعة البيانات التي تحتوي على أعلى نسبة من قراءات المضيف بالنسبة لقراءات الممرض (على وجه التحديد ، 99٪ يقرأ المضيف / 1٪ يقرأ الممرض). تقرأ الغالبية العظمى من المضيف الذي تم تخطيطه من أجزاء متكررة من الجينوم. وفقًا لما تحدده featureCounts ، فإن 1.6٪ فقط من S. octosporus تحتوي الجينات على أكثر من 50 قراءة مضيفة لها (الجدول S5) ، وتنوعت هذه الجينات في الوظيفة البيولوجية (الجدول S4).

قارنا محاذاة من نفس مجموعة البيانات المحاكاة بالجينوم المستهدف لـ S. octosporus تم إجراء محاذاة واحدة عن طريق تعيين القراءات الأولية للجينوم باستخدام TopHat2 (الذي لم يخطئ في قراءة المضيف) وتم إجراء الآخر عن طريق تعيين القراءات الأولية على الجينوم باستخدام STAR (والتي تضمنت تعيين قراءات المضيف). توجد قائمة مرتبة بالتغييرات المنتظمة على مقياس اللوغاريتم 2 في المادة التكميلية (الجدول S3). 97.1 ٪ من الجينات التي تم التعبير عنها بشكل مختلف (أعلى من تغيير 0.1 مرة على مقياس السجل 2) بين المحاذاة تم التعبير عنها بشكل مفرط في المحاذاة التي حدث فيها تعيين قراءة المضيف. يشير هذا إلى أن عدم تطابق القراءات مع المرجع الخاطئ في تسلسل الحمض النووي الريبي المزدوج يمكن أن يؤدي إلى تحيزات تصاعدية في تقديرات التعبير الجيني. وهكذا ، بالمقارنة مع عنصر تحكم غير مصاب ، يبدو أن هذه الجينات المنحازة تصاعديًا "مستحثة" عن طريق العدوى.

3.4 قد تقلل استراتيجيات رسم الخرائط البديلة من مشاكل رسم الخرائط

لقد درسنا ثلاث طرق بديلة يمكن أن تقلل من ضعف رسم الخرائط ورسم الخرائط لبيانات تسلسل الحمض النووي الريبي المزدوجة. لقد بحثنا أولاً في الأساليب التي يمكن أن تكون ممكنة إذا كان الجينوم المضيف متاحًا. لقد حاولنا تصفية قراءات المضيف عن طريق محاذاة مجموعات بيانات RNA-seq المزدوجة مع الجينوم المضيف ، ثم تعيين القراءات غير المعينة لجينوم الممرض المستهدف (أو تلك الخاصة بالأنواع ذات الصلة). هذا النهج "المتسلسل" قلل من كمية قراءة قراءة المضيف بشكل طفيف فقط (الجدول 2). بالنسبة لمعظم عمليات المحاذاة ، انخفضت النسبة المئوية لإجمالي القراءات المعينة التي نشأت من المضيف بنسبة 1-3٪ فقط.

لقد درسنا نهجًا ثانيًا تم فيه تعيين القراءات للجينومات المتسلسلة للمضيف وإما العامل الممرض المستهدف أو الأنواع المرتبطة ارتباطًا وثيقًا بالعامل الممرض. (تصميم "مكان للذهاب"). نتج عن طريقة مكان الذهاب إلى محاذاة باستخدام STAR و NextGenMap وجود عدد أقل بكثير من قراءة العائل لتعيين جينوم الممرض أو الأنواع المرتبطة ارتباطًا وثيقًا بالعامل الممرض مقارنة بالمحاذاة مع الجينوم باستثناء الجينوم المضيف. علاوة على ذلك ، احتفظ كلا المحاذاة بقدرتهما على تعيين قراءات مسببات الأمراض إلى جينومات الأنواع وثيقة الصلة بالممرض المستهدف (الشكل 3 ، الشكل S4). لذلك ، قد تتغلب طريقة مكان العمل على بعض قيود التعيين إلى مرجع ذي صلة في تسلسل الحمض النووي الريبي المزدوج.

أخيرًا ، بحثنا في نهج ثالث تم فيه تجميع القراءات لأول مرة في أجزاء أطول ، ثم تم تعيين تلك الأجزاء إلى جينومات العامل الممرض والأنواع المرتبطة ارتباطًا وثيقًا بالعامل الممرض (نهج "التجميع"). تتألف غالبية contigs المجمعة بالكامل من قراءات المضيف أو كليًا من قراءات مسببات الأمراض (مقاييس التجميع في الشكل S1). كان جزء صغير من contigs عبارة عن خيمرات - أي مزيج من قراءات المضيف ومسببات الأمراض (المسمى "غير محدد"). أدت محاذاة هذه النصوص المجمعة لكل جينوم مرجعي إلى انخفاض كبير في تعيين قراءة المضيف مع الحفاظ على القدرة على تعيين contigs الممرض (الشكل 4 ، الشكل S5). عبر جميع الأنواع المرجعية ونسب العوامل الممرضة تقرأ في مجموعات البيانات الأصلية ، و lt1٪ من contigs المكونة من قراءات المضيف تم تعيينها باستخدام NextGenMap. علاوة على ذلك ، ج. 99٪ من contigs المكون من الممرض يقرأ تعيينها إلى نسخة الهدف S. octosporus. ما يقرب من 79 ٪ من contigs تتألف من قراءات مسببة للأمراض تم تعيينها إلى S. كريوفيلوس ، 29٪ من contigs مكون من قراءات مُمْرِضة تم تعيينها إلى S. بومبي و 15٪ من contigs تتألف من العوامل الممرضة تقرأ تعيينها إلى S. japonicus. على الرغم من أن بعض contigs التي لم يتم تحديدها على أنها مكونة من العامل الممرض أو المضيف يقرأ تعيينها ، إلا أنها كانت تتألف من أقلية من إجمالي عدد contigs المعين ، بحد أقصى 2.5٪. مع هذا الانخفاض في عدم قراءة قراءة المضيف ، نشأت غالبية contigs المعينة من العامل الممرض. بالنظر إلى أن التجميع de novo الجيد ممكن ، فقد قلل نهج التجميع أيضًا بشكل واضح من التعيين.

3.5 تأثير معلمات التسلسل

للتحقيق في تأثير معلمات التسلسل - حجم قراءة التسلسل ، والقراءة ذات النهاية المزدوجة مقابل القراءة أحادية النهاية - في الأساليب المذكورة أعلاه ، قمنا بمحاكاة مجموعات بيانات RNA-seq المزدوجة لنفس النظام بطول قراءة أطول (150 نقطة أساس) و مع تسلسل نهاية مقترنة (الشكل S11 – S16). في حين أن الأنماط نفسها كانت ثابتة إلى حد كبير - أدى تعيين القراءة الأولية إلى عدم تعيين قراءة المضيف عند المحاذاة مع STAR و NextGenMap ورسم الخرائط لجينوم متسلسل أو تجميع قراءات de novo قبل تعيين مخطط قراءة مضيف مخفض بشكل كبير - كانت هناك بعض الاختلافات بين التخطيطات . على وجه التحديد ، لم تؤد أطوال القراءة الأطول إلى معدلات عدم رسم خرائط للقراءة الإجمالية للمضيف (وهو ما يتوافق مع نتائج تعيين القراءات المجمعة) فحسب ، بل نتج عنها أيضًا معدل رسم خرائط أقل لقراءة مسببات الأمراض ، خاصةً عند تعيين جينومات الأنواع المرتبطة ارتباطًا وثيقًا بالعامل الممرض. . بالإضافة إلى ذلك ، فإن تجميع 76 قراءة مقترنة بنهاية جديدة قبل التعيين إلى ملف شيزوساكارومايس نتج عن الجينوم المزيد من القراءات التي لا يمكن تحديدها على أنها من المضيف أو الممرض (يحتمل أن يكون الكيميرا) الذي يشتمل على مجموعة القراءات المعينة. كما هو متوقع ، كان أداء قراءات النهاية المزدوجة الأطول أفضل بشكل عام من التكوينات الأخرى.

3.6 أوجه التشابه والتباين في الأصناف الأخرى

ركزت عمليات المحاكاة المذكورة أعلاه على "طفيلي" فطري يصيب مضيفًا نباتيًا لأننا نعتقد أن هذا قد يكون سيناريو إشكاليًا بشكل خاص ، حيث أن النباتات والفطريات كلاهما حقيقيات النوى ، بينما تشتمل أنظمة مضيف وممرضات أخرى على أنواع أكثر تباعدًا. لاستكشاف ما إذا كانت الأنماط التي تمت ملاحظتها أعلاه وكيف تمتد إلى أنظمة أخرى ، قمنا بمحاكاة مجموعتين أخريين من مجموعات بيانات RNA-seq المزدوجة. قمنا بمحاكاة مجموعات البيانات عبر نفس النطاق لنسبة قراءات العامل الممرض لنظام مُمْرِض فطري آخر ، الانسان العاقل و المبيضات البيض، وكذلك نظام مسببات الأمراض البكتيرية ، الانسان العاقل و الإشريكية القولونية. بينما محاذاة الإنسان-الكانديدا قراءات خام لجينومات الأنواع المستهدفة ، C. البيض، واثنين من الأنواع وثيقة الصلة ، C. dublinensis و جيم الشلل ، أدى إلى مستوى مشابه من قراءة قراءة المضيف لتعيين التحليلات المذكورة أعلاه (الشكل S6) ، محاذاة الإنسانبكتريا قولونية كان للقراءات الأولية حد أدنى من عدم قراءة أي مضيف (الشكل S10). لقد أجرينا نفس الأساليب الثلاثة الموضحة أعلاه لتقليل تعيين قراءة المضيف مع الإنسان-الكانديدا المحاذاة ، ولاحظنا نفس النتائج كما هو موضح أعلاه - هذا التعيين للجينومات المتسلسلة للمضيف والأنواع ذات الصلة الوثيقة ، بالإضافة إلى تجميع de novo قبل المحاذاة ، يقلل بشكل كبير من قراءة قراءة المضيف مع الاحتفاظ بالقدرة على تعيين يقرأ الممرض (الشكل S7–9). لذلك ، فإن مشاكل التعيين في تسلسل الحمض النووي الريبي المزدوج صمدت ، بدرجات متفاوتة ، عبر الأنظمة التي بحثنا فيها.


تحليل المصب بعد العامل الممرض في الجسم الحي RNAseq - علم الأحياء

تعد الضامة المنشطة بشكل بديل (AAMφ) مكونًا رئيسيًا للاستجابة لعدوى الديدان الطفيلية ، ومع ذلك ، تظل وظائفها محددة بشكل سيئ. لفهم النمط الظاهري لـ AAMφ الناجم عن الديدان الطفيلية بشكل أفضل ، أجرينا تحليلًا على مستوى الأنظمة لـ AAMφ المشتق من الجسم الحي باستخدام نموذج الماوس الثابت. من خلال تسلسل الحمض النووي الريبي من الجيل التالي ، قمنا بتمييز النسخ الضامة للبريتوني من الفئران BALB / c و IL4Rα - / - الناتجة عن الديدان الخيطية بروجيا الملايو، أو عن طريق حقن الثيوجليكولات داخل الصفاق. لقد حددنا ملفات تعريف التعبير عن السيتوكينات والكيموكينات المرتبطة بـ AAMφ ومستقبلاتها ، مما يوفر دليلًا على أن AAMφ يساهم في تجنيد فرط الحمضات والحفاظ عليه. أبرز تحليل المسار تكملة كدالة محتملة لمستجيب AAMφ. تدعم جينات الميتوكوندريا المنظمة في الأدلة المختبرية التي تربط استقلاب الميتوكوندريا بالتنشيط البديل. قمنا بتعيين مواقع بدء نسخ البلاعم ، وتحديد التمثيل الزائد رابطة الدول المستقلة- الزخارف التنظيمية داخل المروجين المرتبطين بـ AAMφ. وشمل ذلك موقع الربط لعوامل النسخ PPAR ، التي تحافظ على التمثيل الغذائي للميتوكوندريا. من المثير للدهشة أن PPARγ ، المتورط في الحفاظ على AAMφ ، كان خاضعًا للرقابة على العدوى. التعبير PPARδ ، ومع ذلك ، تم الحفاظ عليها. لشرح كيفية الحفاظ على التنشيط النسخي بوساطة PPAR ، استخدمنا الشحوم لتحديد eicosanoids المشتقة من AAMφ ، روابط PPAR المحتملة. حددنا PGI يجند PPARδ2 باعتباره eicosanoid المشتق من AAMφ الأكثر وفرة ويقترح PGI2-محور PPARδ يحافظ على AAMφ أثناء ب الملايو زرع.

تم نشره مسبقًا على الإنترنت باسم دم ورقة الطبعة الأولى ، 16 أكتوبر 2012

تحتوي هذه المقالة على ملحق بيانات.

تم تحمل تكاليف نشر هذه المقالة جزئيًا عن طريق دفع رسوم الصفحة. لذلك ، وللإشارة فقط إلى هذه الحقيقة ، تم وضع علامة "إعلان" على هذه المقالة وفقًا لقسم 18 USC 1734.


أساليب

نمو الخميرة وإجراءات أخذ العينات

تم إجراء جميع التجارب باستخدام سلالة الخميرة BY4741 (خلفية S288c MATa his3∆1 ليو 2∆0 ميت 15∆0 ura3∆0) ، تم الحصول عليها من Open Biosystems. لمقارنة طرق عزل الحمض النووي الريبي ، جمعنا ثلاث مكررات "تقنية" متطابقة سعة 10 مل لكل مكرر بيولوجي (4 مكررات بيولوجية في المجموع). نمت الخلايا و GT 8 أجيال في وسط صناعي كامل سعة 100 مل (SC) [16] عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز مداري (270 دورة في الدقيقة) إلى المرحلة الأسية المتوسطة (OD600 0.3-0.6) ، وتمت إزالة 10 مل عينات تمثل السيطرة غير المشددة. لمعالجة الصدمة الحرارية ، تمت إضافة حجم واحد من وسط 55 درجة مئوية إلى الثقافة المتبقية ، وبذلك تصل درجة الحرارة النهائية على الفور إلى 37 درجة مئوية ، وتم تحضين المزرعة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة أخرى قبل إزالة عينات 10 مل. تم جمع كل من الخلايا غير المجهدة والصدمة الحرارية بالطرد المركزي عند 1500 x ز لمدة 3 دقائق ، تم تجميد كريات الخلايا في النيتروجين السائل وتخزينها عند - 80 درجة مئوية حتى المعالجة.

طرق عزل الحمض النووي الريبي

عزل الفينول الساخن

تم تحلل الخلايا وعزل الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة الفينول الساخنة القياسية كما هو موصوف [17] ، ويمكن العثور على بروتوكول مفصل في مستودعات البروتوكولات. باختصار ، تمت إضافة حجم واحد من الفينول المشبع بالحمض وحجم واحد من المخزن المؤقت للتحلل (10 ملي مولار Tris-HCl pH 7.4 ، 10 مم EDTA ، 0.5 ٪ SDS) إلى كريات الخلايا المجمدة ، ودوامة ، ثم وضعها في 65 درجة مئوية مسخن مسبقًا. - الدوامة المحتضنة بالثيرم (المعيار العلمي) عند 1500 دورة في الدقيقة لمدة 45 دقيقة. تم طرد العينات لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية بأقصى سرعة في جهاز طرد مركزي دقيق ، واستخلاصها مرة أخرى بالفينول ، مرة واحدة مع الكلوروفورم ، ثم ترسبت طوال الليل عند -20 درجة مئوية مع 0.1 حجم من أسيتات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2) و 2.5 حجم من أسيتات الصوديوم. 100٪ إيثانول. تم غسل الحمض النووي الريبي المترسب مرة واحدة باستخدام 70 ٪ من الإيثانول ثم تعليقه في TE (10 ملي مولار من Tris-HCl pH 8.0 ، 1 ملي مولار EDTA). تم بعد ذلك "تنظيف" الحمض النووي الريبي المستخرج من الفينول باستخدام مجموعة RNeasy Miniprep Kit مع معالجة DNase اختيارية على العمود وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.

عزل الحمض النووي الريبي مع مجموعتين مختلفتين من مجموعات Miniprep

تم استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعتين مختلفتين: مجموعة Qiagen RNeasy Mini Kit (Cat. 74،104) ومجموعة Zymo Research Direct-zol RNA Miniprep Kit (Cat. R2050). كانت جميع تركيزات الخلايا أقل من الحد الأقصى الموصى به لخلايا 5 × 10 7 من كلا الصانعين (تتراوح من 2.5 × 10 7 –4.5 × 10 7 خلايا). لكلتا المجموعتين ، قمنا بفصل الخلايا ميكانيكيًا باستخدام Beadbeater-24 (3500 ذبذبة / دقيقة ، 45 ثانية على الجليد بين الدورات). تم إجراء التحلل الميكانيكي في أنابيب مغطاة ببراغي سعة 2 مل تحتوي على حجم متساوٍ (600 ميكرولتر) من محلول التحلل (RLT لكاشف RNeasy أو TRI لـ Direct-zol) وحبات زجاجية مغسولة بالحمض (425-600 ميكرومتر ، Sigma-Aldrich ).

ثم تمت تنقية الحمض النووي الريبي وفقًا لبروتوكول كل مصنع للخميرة ، بما في ذلك الهضم الاختياري لـ DNase في العمود. بالنسبة لجميع العينات ، تم قياس كمية الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة Qubit RNA HS Assay و Qubit fluorometer وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم قياس رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN) لكل عينة باستخدام Agilent 2200 TapeStation. يمكن العثور على تركيزات الحمض النووي الريبي وقيم RIN لكل عينة في الجدول التكميلي 1.

تسلسل وتحليل الحمض النووي الريبي

تم إعداد مكتبات RNA-seq من الحمض النووي الريبي المخصب بـ polyA باستخدام مجموعة KAPA Biosystems mRNA HyperPrep Kit (KK8581) ومجموعة محول KAPA المفهرس الفردي A + B (KK8700) ، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. لقد بدأنا بـ 500 نانوغرام إجمالي RNA ، وتم تحسين وقت التجزئة (6 دقائق) لتوليد 200-300 شظايا من الحمض النووي الريبي ، وتم تضخيم المكتبات بـ 9 دورات من تفاعل البوليميراز المتسلسل. تم إنشاء جميع المكتبات في دفعة واحدة من خلال روبوت آلي لمعالجة السوائل Eppendorf epMotion 5075 ، ويمكن العثور على بروتوكول مفصل على Protocols.io ضمن DOI dx.doi.org/10.17504/protocols.io.uueewte. تم تسلسل مكتبات (كدنا) على HiSeq4000 في مرفق جامعة شيكاغو لعلم الجينوم ، مما أدى إلى إنشاء قراءات أحادية النهاية تبلغ 50 نقطة أساس.

تم قطع القراءات من قراءات منخفضة الجودة وتسلسل المحول (مؤشرات KAPA v1) باستخدام Trimmomatic (الإصدار 0.32) [18] ، باستخدام الأوامر التالية: ILLUMINACLIP: Kapa_indices.fa: 2: 30: 10 LEADING: 3 TRAILING: 3 MAXINFO: 40: 0.4 MINLEN: 40. تم تعيين القراءات على جينوم S288c (الإصدار Scer3) ، باستخدام STAR (الإصدار 020201) [19]. يمكن العثور على إحصائيات رسم الخرائط في الجدول التكميلي 2. تم حساب النصوص لكل مليون (TPM) والأعداد المتوقعة لكل جين باستخدام RSEM (الإصدار 1.3.1) [20]. يمكن العثور على إخراج RSEM في ملف إضافي 2.

تم إجراء تحليل التعبير التفاضلي باستخدام edgeR حزمة الموصل الحيوي (الإصدار 3.22.3) باستخدام إطار شبه الاحتمال (QL). بالنسبة لنموذج QL ، تم استخدام نوع العينة (على سبيل المثال ، الفينول غير المضغوط ، وصدمة الفينول الحرارية ، و RNeasy غير مجهدة ...) والنسخ البيولوجي كعوامل. لحساب الاختلافات في RIN عبر العينات ، أجرينا أيضًا تحليلًا منفصلاً شمل نوع العينة والتكرار و RIN كعوامل في النموذج. للتحكم في الاختلافات في عمق التسلسل عبر العينات ، تم استخدام أعداد وظيفة edgeR لتعدادات العينات الفرعية العشوائية عبر جميع العينات لتكون مساوية للعينة مع أقل عدد من إجمالي الأعداد (8678188). تم تضمين الجينات التي تحتوي على عدد واحد على الأقل لكل مليون (CPM) في حالة واحدة على الأقل من أجل تطبيع TMM وتحليل التعبير التفاضلي. تتوفر جميع بيانات RNA-seq من خلال قاعدة بيانات المعاهد الوطنية للصحة الجينية للتعبير الجيني الشامل (GEO) تحت رقم الانضمام. GSE135430 ، ويمكن العثور على مخرجات edgeR في ملف إضافي 3.

تم إجراء تحليل المكون الرئيسي (PCA) باستخدام ClustVis [21] على قيم TPM المحولة من ln لجميع النصوص المضمنة في تحليل التعبير التفاضلي ، باستخدام مقياس تباين الوحدة وتحلل القيمة الفردية. تم إجراء التجميع الهرمي باستخدام Cluster 3.0 (//bonsai.hgc.jp/

mdehoon / software / الكتلة / software.htm) باستخدام ارتباط بيرسون غير المتمركز والربط المركزي كمقياس [22]. تم ترجيح عينات RNA-seq باستخدام قيمة قطع قدرها 0.4 وقيمة أسية 1. تم إجراء إثراء وظيفي لفئات علم الجينات (GO) باستخدام GO-TermFinder (https://go.princeton.edu/cgi-bin/GOTermFinder) ) [23] ، مع تصحيح Bonferroni ص- القيم & lt 0.01 تؤخذ على أنها ذات دلالة. يمكن العثور على القوائم الكاملة للفئات المخصبة في الملف الإضافي 4. تم إجراء اختبار التكافؤ على نسب مجموعات الجينات باستخدام اختبارين من جانب واحد (TOST) من خلال حزمة TOSTER R (الإصدار 0.3.4) [24] ، باستخدام مستوى ألفا 0.05 وحدود معادلة +/ 0.029 (10٪ من نسبة الخلفية).

PCR الكمي

ستة جينات إما أعلى بكثير (LAS17 ، SED1 ، PRY3) أو أقل (JNM1 ، EAF7 ، RRP36) تم التحقق من وفرة الفينول مقابل Kit RNA-seq من خلال PCR الكمي في الوقت الحقيقي باستخدام Maxima SYBR-qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific) و Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System وصفها [25]. باختصار ، تم تصنيع (كدنا) من نفس عينات الحمض النووي الريبي المستخدمة في تسلسل الحمض النووي الريبي باستخدام 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي الإجمالي ، و 3 ميكروغرام من oligo-dT (T20VN) ، و SuperScript III (Thermo Fisher Scientific) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم استخدام نانوغرام واحد من (كدنا) كقالب ، وتم إجراء qPCR باستخدام معلمات الدراجات الحرارية التالية: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، 40 دورة 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 55 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة لمدة 40 دورة ، تليها ذوبان تحليل المنحنى للتحقق من وجود amplicon واحد فقط. تم تحديد قيم Cq باستخدام تحليل الانحدار ، مع طرح خط الأساس عبر ملاءمة المنحنى. تم تحديد الوفرة النسبية بين العينات باستخدام طريقة ∆∆Ct [26] ، بالتطبيع إلى إيرف 25 كجينة تحكم لا يتأثر تعبيرها بضغوط مختلفة [27]. بروتوكول مفصل متاح على protocols.io تحت DOI dx.doi.org/10.17504/protocols.io.bbgpijvn.


قد تكون مهتم ايضا ب

تتمتع Evotec بخبرة طويلة في علم الأورام ، بما في ذلك المساهمة في العديد من المرشحين السريريين وعقار واحد يتم تسويقه. تقدم Evotec مجموعة من نماذج xenograft الفأرية والتناسلية والمثالية ، إلى جانب إمكانية مجموعة واسعة من قراءات الفعالية والعلامات الحيوية. يؤدي الوصول إلى منصة الماوس المتوافقة مع البشر إلى توسيع نطاق تقييم تأثيرات الأدوية مع خصوصية الأنواع أو على مجموعات محددة من المرضى.

CD3 (الخلايا الليمفاوية التائية) ونقص الأكسجين (مناطق نقص الأكسجة) تلطيخ مزدوج في ورم 4T1

تتمتع Evotec أيضًا بإمكانية الوصول إلى مجموعة من أنسجة الورم البشرية عبر Institut Universitaire du Cancer Toulouse والتي يمكن استخدامها لدراسات العلامات الحيوية أو خارج الجسم الحي التقييمات بما في ذلك العلاج المركب.

نماذج الأورام وعلم الأورام المناعي

  • نماذج طعم أجنبي متعامد (وتحت الجلد) في أعضاء متعددة
  • نماذج Syngeneic المناسبة لتقييم علاجات الأورام المناعية (وحدها أو بالاشتراك مع تكنولوجيا المعلومات والاتصالات)
  • الفأر المتوافق مع البشر ، النماذج المسببة للسرطان والنقائل
  • تصوير دوبلر بالليزر والأشعة السينية لتدفق الدم والتقييمات التشريحية

الهدف تلطيخ مادة الورم المريض

القراءات الرئيسية

  • تقييم الفعالية عن طريق حجم الورم أو التصوير بالتلألؤ البيولوجي أو العلامات البديلة
  • تحليل الدم الكامل بما في ذلك FACS و ELISpot
  • التحليل البيولوجي وصياغة دراسات PK / PD المرتبطة بها
  • قراءات قابلة للترجمة سريريًا على الأنسجة (الإنسان والفأر):
    • IHC المستندة إلى Ventana وعلم الأنسجة مدعومًا بتحليل الصور الكمي (Definiens)
    • دراسات الجينوم بما في ذلك RT-qPCR و TLDA
    • البروتينات والمقايسات المناعية
    • الأيض وتقدير اللاكتات والجلوكوز والجلوتامين والجلوتامات

    يكشف تحليل التنميط النسخي عن استجابة مقاومة متميزة لأوراق الخيار المصابة بالعفن الدقيقي

    مختبر شاندونغ الرئيسي لبيولوجيا خضروات الدفيئة ، فرع شاندونغ للمركز الوطني لتحسين الخضروات ، أكاديمية شاندونغ للعلوم الزراعية ، معهد الخضروات والزهور ، جينان ، الصين

    كلية علوم الحياة والبيئة ، جامعة هوانشان ، هوانغشان ، الصين

    مختبر شاندونغ الرئيسي لبيولوجيا خضروات الدفيئة ، فرع شاندونغ للمركز الوطني لتحسين الخضروات ، أكاديمية شاندونغ للعلوم الزراعية ، معهد الخضروات والزهور ، جينان ، الصين

    كلية الغابات ، جامعة هاينان ، هايكو ، الصين

    مختبر شاندونغ الرئيسي لبيولوجيا خضروات الدفيئة ، فرع شاندونغ للمركز الوطني لتحسين الخضروات ، أكاديمية شاندونغ للعلوم الزراعية ، معهد الخضروات والزهور ، جينان ، الصين

    مختبر شاندونغ الرئيسي لبيولوجيا خضروات الدفيئة ، فرع شاندونغ للمركز الوطني لتحسين الخضروات ، أكاديمية شاندونغ للعلوم الزراعية ، معهد الخضروات والزهور ، جينان ، الصين

    مختبر شاندونغ الرئيسي لبيولوجيا خضروات الدفيئة ، فرع شاندونغ للمركز الوطني لتحسين الخضروات ، أكاديمية شاندونغ للعلوم الزراعية ، معهد الخضروات والزهور ، جينان ، الصين

    كلية العلوم والتكنولوجيا الزراعية ، جامعة شاندونغ للزراعة والهندسة ، جينان ، الصين

    دبليو ليو ، كلية العلوم والتكنولوجيا الزراعية ، جامعة شاندونغ للزراعة والهندسة ، جينان 250100 ، الصين.

    W. Zhang ، معهد الخضار والزهور ، أكاديمية شاندونغ للعلوم الزراعية ومختبر شاندونغ الرئيسي لبيولوجيا خضروات الدفيئة وفرع شاندونغ للمركز الوطني لتحسين الخضروات ، جينان 250100 ، الصين

    مختبر شاندونغ الرئيسي لبيولوجيا خضروات الدفيئة ، فرع شاندونغ للمركز الوطني لتحسين الخضروات ، أكاديمية شاندونغ للعلوم الزراعية ، معهد الخضروات والزهور ، جينان ، الصين

    دبليو ليو ، كلية العلوم والتكنولوجيا الزراعية ، جامعة شاندونغ للزراعة والهندسة ، جينان 250100 ، الصين.

    W. Zhang ، معهد الخضار والزهور ، أكاديمية شاندونغ للعلوم الزراعية ومختبر شاندونغ الرئيسي لبيولوجيا خضروات الدفيئة وفرع شاندونغ للمركز الوطني لتحسين الخضروات ، جينان 250100 ، الصين

    مختبر شاندونغ الرئيسي لبيولوجيا خضروات الدفيئة ، فرع شاندونغ للمركز الوطني لتحسين الخضروات ، أكاديمية شاندونغ للعلوم الزراعية ، معهد الخضروات والزهور ، جينان ، الصين

    كلية علوم الحياة والبيئة ، جامعة هوانشان ، هوانغشان ، الصين

    مختبر شاندونغ الرئيسي لبيولوجيا خضروات الدفيئة ، فرع شاندونغ للمركز الوطني لتحسين الخضروات ، أكاديمية شاندونغ للعلوم الزراعية ، معهد الخضروات والزهور ، جينان ، الصين

    كلية الغابات ، جامعة هاينان ، هايكو ، الصين

    مختبر شاندونغ الرئيسي لبيولوجيا خضروات الدفيئة ، فرع شاندونغ للمركز الوطني لتحسين الخضروات ، أكاديمية شاندونغ للعلوم الزراعية ، معهد الخضروات والزهور ، جينان ، الصين

    مختبر شاندونغ الرئيسي لبيولوجيا خضروات الدفيئة ، فرع شاندونغ للمركز الوطني لتحسين الخضروات ، أكاديمية شاندونغ للعلوم الزراعية ، معهد الخضروات والزهور ، جينان ، الصين

    مختبر شاندونغ الرئيسي لبيولوجيا خضروات الدفيئة ، فرع شاندونغ للمركز الوطني لتحسين الخضروات ، أكاديمية شاندونغ للعلوم الزراعية ، معهد الخضروات والزهور ، جينان ، الصين

    كلية العلوم والتكنولوجيا الزراعية ، جامعة شاندونغ للزراعة والهندسة ، جينان ، الصين

    دبليو ليو ، كلية العلوم والتكنولوجيا الزراعية ، جامعة شاندونغ للزراعة والهندسة ، جينان 250100 ، الصين.

    W. Zhang ، معهد الخضار والزهور ، أكاديمية شاندونغ للعلوم الزراعية ومختبر شاندونغ الرئيسي لبيولوجيا خضروات الدفيئة وفرع شاندونغ للمركز الوطني لتحسين الخضروات ، جينان 250100 ، الصين

    مختبر شاندونغ الرئيسي لبيولوجيا خضروات الدفيئة ، فرع شاندونغ للمركز الوطني لتحسين الخضروات ، أكاديمية شاندونغ للعلوم الزراعية ، معهد الخضروات والزهور ، جينان ، الصين

    دبليو ليو ، كلية العلوم والتكنولوجيا الزراعية ، جامعة شاندونغ للزراعة والهندسة ، جينان 250100 ، الصين.

    W. Zhang ، معهد الخضار والزهور ، أكاديمية شاندونغ للعلوم الزراعية ومختبر شاندونغ الرئيسي لبيولوجيا خضروات الدفيئة وفرع شاندونغ للمركز الوطني لتحسين الخضروات ، جينان 250100 ، الصين

    الملخص

    • البياض الدقيقي هو المرض الرئيسي الذي يصيب زراعة الخيار ويسبب خسائر اقتصادية فادحة. حتى الآن ، لم تسفر الأبحاث حول مقاومة الخيار للبياض الدقيقي عن حلول مجدية.
    • اختارت هذه الدراسة سطرين من الخيار الفطري ، XY09-118 (مقاوم) و Q10 (حساس) وبحثت في استجابتهما لعدوى البياض الدقيقي (تم حصادهما بعد 24 و 48 ساعة بعد التلقيح) باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي.
    • تم اكتشاف أكثر من 20000 جين في أوراق الخيار مع أو بدون عدوى البياض الدقيقي في النقطتين الزمنيتين المذكورتين أعلاه. من بين هؤلاء ، تم تحديد 5478 جينًا كجينات معبر عنها بشكل مختلف (DEGs) بين XY09-118 و Q10. بناءً على قواعد البيانات GO و KEGG ، تم تحليل وظائف DEGs. علاوة على ذلك ، تم تقييم الشبكة التنظيمية المعقدة لمقاومة البياض الدقيقي ، والتي تتضمن نقل إشارة هرمون النبات ، والتخليق الحيوي للفينيل بروبانويد ، والتفاعل بين مسببات الأمراض النباتية ومسار إشارات MAPK. على وجه الخصوص ، تم تسليط الضوء على الجينات التي ترميز WRKY و NAC و TCP. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحليل الجينات المشاركة في التخليق الحيوي للهرمونات النباتية ، والتمثيل الغذائي ونقل الإشارات ، ومقاومة العوامل الممرضة والاستجابة غير الحيوية للضغط.أشار تحليل التعبير المشترك إلى أن عوامل النسخ مرتبطة بمسار إشارة هرمون النبات والتمثيل الغذائي والدفاع والاستجابة اللاأحيائية. تم التحقق من صحة التعبير عن عدة جينات بواسطة qRT-PCR. تم التعرف على شبكة تنظيم مقاومة العوامل الممرضة من خلال مقارنة السلالات الفطرية المقاومة والقابلة للتأثر بالعدوى بالفطريات الدقيقية.
    • توفر بيانات النسخ رؤى جديدة حول استجابة الخيار لعدوى البياض الدقيقي وستكون جينات مقاومة العوامل الممرضة المحددة مفيدة للغاية لجهود التكاثر لتعزيز مقاومة الخيار للعفن الدقيقي.
    اسم الملف وصف
    مستند plb13213-sup-0001-FigS1.docxWord ، 1،018.5 كيلوبايت الشكل S1. تحليل التغطية الجينية لـ 24 عينة.
    plb13213-sup-0002-FigS2.docx مستند Word ، 2.9 ميغابايت الشكل S2. نتائج تحليل التشبع التسلسلي.
    plb13213-sup-0003-FigS3.jpg صورة JPEG ، 6.3 ميجا بايت الشكل S3. معاملات الارتباط بين ثلاث مكررات بيولوجية لكل عينة.
    plb13213-sup-0004-TableS1.xlsxapplication / excel ، 10.1 كيلوبايت الجدول S1. مواد أولية لتحليل qRT-PCR.
    plb13213-sup-0005-TableS2.xlsxapplication / excel ، 13.9 كيلوبايت الجدول S2. التحقق من نتائج RNA-seq باستخدام qRT-PCR. أظهرت النتائج متوسط ​​قيم Ct لـ 16 جينًا تم اختيارهم عشوائيًا في أوراق الخيار.
    plb13213-sup-0006-TableS3.xlsxapplication / excel ، 10.9 كيلوبايت الجدول S3. أحداث RNA-seq المعينة.
    plb13213-sup-0007-TableS4.xlsxapplication / excel ، 147.2 كيلوبايت الجدول S4. DEGs في Q10 24 ساعة بعد تلقيح البياض الدقيقي.
    plb13213-sup-0008-TableS5.xlsxapplication / excel ، 55.5 كيلوبايت الجدول S5. DEGs في Q10 48 ساعة بعد تلقيح البياض الدقيقي.
    plb13213-sup-0009-TableS6.xlsxapplication / excel ، 148.1 كيلوبايت الجدول S6. DEGs في XY09-118 24 ساعة بعد تلقيح البياض الدقيقي.
    plb13213-sup-0010-TableS7.xlsxapplication / excel ، 443.4 كيلوبايت الجدول S7. DEGs في XY09-118 48 ساعة بعد تلقيح البياض الدقيقي.
    plb13213-sup-0011-TableS8.xlsxapplication / excel ، 466.6 كيلوبايت الجدول S8. DEGs في Q10 و XY09-118 24 ساعة بعد تلقيح البياض الدقيقي.
    plb13213-sup-0012-TableS9.xlsxapplication / excel ، 692.4 كيلوبايت الجدول S9. DEGs في Q10 و XY09-118 48 ساعة بعد تلقيح البياض الدقيقي.
    plb13213-sup-0013-TableS10.xlsxapplication / excel ، 380.1 كيلوبايت الجدول S10. DEGs في Q10 و XY09-118 تحت السيطرة العلاج بعد 24 ساعة.
    plb13213-sup-0014-TableS11.xlsxapplication / excel ، 499.6 كيلوبايت الجدول S11. DEGs في Q10 و XY09-118 تحت السيطرة العلاج بعد 48 ساعة.
    plb13213-sup-0015-TableS12.xlsxapplication / excel ، 633.3 كيلوبايت الجدول S12. شروط GO الرئيسية المخصبة لـ DEGs في ثمانية مقارنات زوجية.
    plb13213-sup-0016-TableS13.xlsxapplication / excel ، 149.2 كيلوبايت الجدول S13. تحليل التعبير المشترك لعوامل النسخ والجينات النهائية في Q10 و XY09-118 24 ساعة بعد عدوى البياض الدقيقي.
    plb13213-sup-0017-TableS14.xlsxapplication / excel ، 1.3 ميجا بايت الجدول S14. تحليل التعبير المشترك لعوامل النسخ والجينات المصب في Q10 و XY09-118 48 ساعة بعد عدوى البياض الدقيقي.

    يرجى ملاحظة ما يلي: الناشر غير مسؤول عن محتوى أو وظيفة أي معلومات داعمة مقدمة من المؤلفين. يجب توجيه أي استفسارات (بخلاف المحتوى المفقود) إلى المؤلف المقابل للمقالة.


    نتائج

    توليد AAM & # x003c6 وتحليل التعبير التفاضلي

    أنشأنا NeM & # x003c6 و ThioM & # x003c6 عن طريق زرع الفئران BALB / c و IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 باستخدام الديدان الخيطية ب الملايو، أو عن طريق إعطاء مادة ثيوجليكولات داخل الصفاق لاستنباط مجموعة من الضامة غير المستقطبة الشبيهة بالالتهابات. يزيد التحفيز IL4 من التعبير السطحي لـ F4 / 80 على الضامة. 5 لإثراء AAM & # x003c6 في إعداد الزرع ، جمعنا ألمع F4 / 80 + مجموعة البلاعم في كل حالة (الشكل التكميلي 1). تم تعظيم نقاء البلاعم عن طريق استبعاد الخلايا الميتة ، والمزدوجة ، والخلايا البائية (B220 +) ، والحمضات (SiglecF +) ، وخلايا CD4 + T باستخدام بوابات سلبية (الشكل 1 أ). نتج عن إستراتيجية الفرز الخاصة بنا نقاء بنسبة 97.3٪ في المتوسط ​​(النطاق ، 94.9٪ -99.4٪ ، الجدول الإضافي 1). تم تأكيد التنشيط البديل لـ WT-NeM & # x003c6 مع تلطيخ السيتوكين داخل الخلايا لـ RELM & # x003b1 (الشكل 1 ب-ج). في المتوسط ​​، 47٪ من WT-NeM & # x003c6 كانت RELM & # x003b1 إيجابية ، بما يتفق مع 30٪ -60٪ إيجابية تُرى عادةً بعد ب الملايو زرع. أسفرت مكتبات RNA-Seq عن ما بين 11 مليون و 30 مليون قراءة ذات نهاية مزدوجة من 51 قاعدة. تم قياس التعبير الجيني عن طريق تعيين القراءات على الجينوم المرجعي للماوس باستخدام TopHat. 14 إجمالاً 55٪ -73٪ من القراءات تم تعيينها بشكل فريد للجينوم ، مع 7.7-25 مليون رسم خرائط داخل exons للجينات المعروفة (Ensembl الإصدار 58 ، الجدول 1). تم التعبير عن جينات ترميز البروتين بين 1253 و 13520 (56٪ -59٪) في كل مجموعة ، مع 12039 من هذه الجينات المشتركة لجميع المجموعات السكانية الأربعة (الشكل 2 أ). تحققنا من نقاء العينة من خلال تقييم التعبير عن جينات العلامة المقيدة النسب للملوثات المحتملة الحمضات ، العدلات ، والخلايا البائية (الجدول التكميلي 2). مع هذا النهج ، أكدنا وجود تلوث ضئيل للعدلات أو الحمضات ، ومع ذلك ، فإن مستوى منخفض من سي دي 19 تمت ملاحظة التعبير في IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -NeM & # x003c6.

    الجدول 1

    إحصائيات التسلسل ورسم الخرائط لبيانات Illumina الأولية

    أضنىعلاج او معاملةيكررإجمالي القراءاترقم التعيينتم تعيين٪يقترن بشكل صحيح٪ يقترن بشكل صحيحسينجلتونس٪ مفرداتقراءات فريدة في شروح المجموعة v58٪ عدد مرات القراءة الفريدة في تعليقات المجموعة v58
    بالب / جمصاب135 646 76024 026 74267.418 883 06478.593 802 88215.8313 914 67357.9
    بالب / جمصاب239 663 69426 450 84473.321 349 67280.714 071 57815.3915 261 02857.7
    بالب / جمصاب340 960 17626 670 82665.120 637 67677.384 486 60216.8215 578 57358.4
    بالب / جثيو140 398 23226 011 65264.321 817 52083.883 454 42613.2814 732 92056.6
    بالب / جثيو248 366 77433 194 64368.626 782 50280.685 494 17316.5519 344 27558.2
    بالب / جثيو345 552 29628 796 12963.224 350 13284.564 167 41114.4716 480 89657.2
    IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 مصاب156 700 55231 428 89655.427 125 04486.314 172 29813.2817 799 75456.6
    IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 مصاب223 150 35815 076 79765.112 977 82486.081 911 07512.688 493 65956.3
    IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 مصاب360 376 96042 872 36571.032 888 16276.716 826 78715.9224 849 42657.9
    IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 ثيو140 492 83824 144 54159.619 772 78281.893 547 65314.6913 845 96657.3
    IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 ثيو222 996 48213 033 13456.78 952 74268.692 418 16818.557 725 61959.2
    IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 ثيو336 062 84419 911 07355.214 751 22874.093 874 77519.4611 892 85959.7

    التعبير الجيني العام وتحليل التعبير التفاضلي. (أ) عدد الجينات المعبر عنها في مجموعات البلاعم حيث يتم التعبير عنها على أنها قراءة واحدة على الأقل لرسم خرائط للجين في جميع التكرارات الثلاثة للحالة. (ب) مجموعات هرمية غير خاضعة للإشراف من الممرات الفردية توضح التجمعات المنفصلة للتكرارات البيولوجية. (ج) ملخص جينات DE (ص & # x0003c .01) في كل مقارنة زوجية توضح العدد الإجمالي لجينات DE (داخلي) ، وانهيار يوضح اتجاه التعبير التفاضلي لكل من المعتدلين (سجل التغيير 2 أضعاف & # x000b1 2-4) وعالي (سجل 2 أضعاف التغيير & # x0003e 4) جينات DE.

    التجميع الهرمي لملفات تعريف التعبير الجيني العالمي قام بتجميع مكتبات RNA-Seq وفقًا للحالة البيولوجية ، مما يعيد التأكيد على جودة تحليلنا وإمكانية استنساخه (الشكل 2 ب). بعد تحليل التعبير التفاضلي ، حددنا اختلافات كبيرة في النسخ بين مجموعات البلاعم في 3 مقارنات رئيسية (الشكل 2 ج). باستخدام أ ص قطع قيمة .01 بعد التصحيح للاختبار المتعدد (طريقة Benjamini-Hochberg) ، حددنا 4571 جينات DE بين WT-NeM & # x003c6 و WT-ThioM & # x003c6 ، 4561 DE جينات بين WT-NeM & # x003c6 و IL4R & # x003b1 & # جينات x02212 / & # x02212 -NeM & # x003c6 و 3271 DE بين WT-ThioM & # x003c6 و IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -ThioM & # x003c6 (الشكل 2 C). قائمة الجينات الكاملة والمرتبطة بها ص يتم توفير القيم في الجدول التكميلي 3. لقد لاحظنا عددًا أكبر من جينات DE بين WT-NeM & # x003c6 و IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -NeM & # x003c6 من بين WT- ThioM & # x003c6 و IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -ThioM & # x003c6 (الشكل 2 ج). بالإضافة إلى ذلك ، كانت أحجام هذه الاختلافات أكبر بكثير في وضع العدوى (الشكل التكميلي 7). علاوة على ذلك ، لوحظ نطاق مماثل من التعبير التفاضلي بين WT-NeM & # x003c6 و WT-ThioM & # x003c6 كما في WT-NeM & # x003c6 و IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -NeM & # x003c6. وهكذا ، كما هو متوقع ، أدت الإشارات المعتمدة على IL4R & # x003b1 إلى تغييرات كبيرة في ملف تعريف النسخ الضامة استجابةً للمنبهات المناعية التي تحفز Th2.

    لقد استجوبنا ملفات تعريف التعبير عن جينات DE لتحديد تلك المرتبطة صراحةً بالتنشيط البديل. تم تجميع جميع جينات DE من WT-NeM & # x003c6 مقابل WT-ThioM & # x003c6 و WT-NeM & # x003c6 مقابل IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -NeM & # x003c6 (4571 و 4561 على التوالي) ملف تعريف التعبير باستخدام التجميع الهرمي التكتلي. تم تقسيم الشجرة الناتجة إلى 20 مجموعة ، وتم تقييم ملف تعريف التعبير عن الجينات في كل مجموعة (الشكل التكميلي 8). حددنا 5 مجموعات ذات مستويات تعبير متزايدة في WT-NeM & # x003c6 بالنسبة إلى كل من WT-ThioM & # x003c6 و IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -NeM & # x003c6. تم تصنيفها على أنها AAM & # x003c6-up (الشكل 3 الجدول التكميلي 4). وبالمثل ، تم تحديد 5 مجموعات باستخدام ملفات تعريف التعبير العكسي وتم تصنيفها على أنها AAM & # x003c6-down. في المجموع ، تم تحديد 1658 جينًا AAM & # x003c6-up و 1735 AAM & # x003c6-down الجينات (الشكل 3). الأهم من ذلك ، يمكننا أن نذكر أن تعبير الجينات في مجموعات AAM & # x003c6-up و AAM & # x003c6-down يعتمد على IL4R & # x003b1. ومع ذلك ، نظرًا لأن الفئران IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 تفتقر إلى تعبير IL4R & # x003b1 في جميع الخلايا ، لا يمكننا تحديد ما إذا كانت هذه التأثيرات مستقلة عن الخلية ، وفي بعض الحالات ، قد تعكس تغييرات أخرى ، مثل تنشيط خلية Th2 .

    ملفات تعريف التعبير لمجموعات الجينات المرتبطة بـ AAM المعبر عنها تفاضليًا & # x003c6. مجموعات تعبيرات الجينات ترتبط بشكل إيجابي وسلبي بالتنشيط البديل (AAM & # x003c6-up و AAM & # x003c6-down). جميع الجينات ذات الدلالة الإحصائية (ص & # x0003c .01) بين WT-NeM & # x003c6 و WT-ThioM & # x003c6 و WT-NeM & # x003c6 و IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -NeM & # x003c6 ، تم تجميعها باستخدام التسلسل الهرمي. يتم رسم كل جين داخل مجموعة تعبير باللون الأزرق ، ويتم تراكب التعبير المتوسط ​​لجميع الجينات داخل كل مجموعة باللون الأسود. يمثل الرقم الموجود في كل لوحة العدد الإجمالي للجينات في تلك المجموعة.

    التعبير التفاضلي عن المؤثرات المناعية

    لقد استنتجنا أن تقييمًا وصفيًا قائمًا على المعرفة لمصطلحات GO ذات الصلة من الناحية المناعية (بما في ذلك السيتوكينات والكيموكينات ومستقبلاتها GO مصطلحات GO: 0005125 ، GO: 0008009 ، GO: 0004896 ، و GO: 0004950 ، على التوالي تسمى المؤثرات المناعية) سيوفر نظرة ثاقبة على وظيفة وتنظيم AAM & # x003c6. تم تعريف المؤثرات المناعية التي كانت موجودة في مجموعات AAM & # x003c6-up و AAM & # x003c6-down على أنها AAM & # x003c6 مرتبطة. باستخدام هذا المعيار ، حددنا ارتباط AAM & # x003c6 لـ 16 سيتوكينات و 11 مستقبلات سيتوكينات و 10 كيموكينات و 8 مستقبلات كيموكين (الشكل 4). نناقش هنا وظيفة المؤثرات المناعية المرتبطة بـ AAM & # x003c6 ، مما يوفر نظرة ثاقبة على الجوانب المعتمدة على IL4R & # x003b1 لاستجابة البلاعم لعدوى الديدان الخيطية في الجسم الحي وتحديد الجينات المرشحة للتحقيقات المستقبلية.

    خريطة الحرارة للمؤثرات المناعية البديلة المعدلة التنشيط. تم تحديد جينات المستجيب المناعي ، السيتوكينات ، الكيموكينات ، ومستقبلاتها الخاصة (GO: 0005125 ، GO: 0008009 ، GO: 0004896 ، و GO: 0004950 ، على التوالي) ، في مجموعات AAM & # x003c6 المرتبطة بناءً على التعليقات التوضيحية لعلم الجينات. يكشف تحليل المجموعات الهرمية عن ملف تعريف فريد للتعبير عن المؤثرات المناعية المرتبطة بـ AAM & # x003c6.

    ملامح التعبير عن مستقبلات Chemokine و chemokine.

    كان ملف تعريف التعبير الكيميائي AAM & # x003c6 (الشكل 4) متسقًا مع الصيانة الضامة للوسط الخلوي في التجويف البريتوني ب الملايو& # x02013 الفئران المزروعة ، والتي تتكون أساسًا من الخلايا البائية والضامة والحمضات. 15 يتم التعبير عن جميع مجموعات البلاعم التي تم فحصها بكثرة وبشكل أساسي سيكل 6 و Ccl9 (الجدول التكميلي 5) ، والذي قد يعمل على الحفاظ على تجمعات البلاعم داخل التجويف البريتوني. 16 في مجموعات AAM & # x003c6-up ، حددنا العوامل الكيميائية الجاذبة للحمضات سيكل 24 و Ccl8، 16 كما تم التعبير عنها بكثرة ومتوسطة ، على التوالي. سي اكس سي ال 12 و سي اكس سي ال 13 تم تحديدها أيضًا على أنها AAM & # x003c6 مرتبطة ، ومع ذلك ، تم التعبير عنها بمستويات أقل بكثير. بما يتوافق مع النمط الظاهري المضاد للالتهابات أو غير الالتهابي لـ AAM & # x003c6 ، 1 تحتوي مجموعات AAM & # x003c6-down Ccl3 (Mip1 & # x003b1) ، Ccl4, Ccl2 (MCP-1) ، سيكل 7 (MCP-3) و Cxcl14، وكلها تشارك في التهاب المرحلة الحادة ، وتجذب في المقام الأول الخلايا الوحيدة والعدلات. 17

    ومن المثير للاهتمام أن مجموعات AAM & # x003c6-up كانت خالية من المستقبلات الكيميائية باستثناء Cxcr7 (الشكل 4). يستجيب Cxcr7 لـ Cxcl12 المشتق من اللحمية ، مما يؤثر على كل من الهجرة والتمايز في الخلايا الوحيدة. 18 Ccr1 (مستقبلات MIP-1 & # x003b1 ، الجدول التكميلي 5) تم التعبير عنها أيضًا بشكل كبير بواسطة الضامة ، ولكن لم يتم تصنيفها على أنها AAM & # x003c6 مرتبطة. وبالتالي، Cxcr7 و / أو Ccr1 قد تكون المحددات الرئيسية لتوطين AAM الناجم عن الديدان الخيطية & # x003c6. 17،18 كان هناك عدد كبير من مستقبلات الكيمياء موجودة في مجموعات AAM & # x003c6-down. وشملت هذه Ccr2, Cxcr1, Cxcr2, Cxcr3, سي سي آر 5، و Ccrl2، مما يعني أن AAM & # x003c6 ضعيف في قدرتها على الاستجابة للعديد من الكيميائيات. يشير هذا إلى أن WT-NeM & # x003c6 لا يهاجر إلى استجابات الخلايا اللمفاوية التائية الأولية ، على الرغم من التعبير العالي عن MHCII وعرض المستضد الوظيفي. 19 ، 20

    ملامح التعبير عن مستقبلات السيتوكين والسيتوكين.

    عادة ما يتم الحفاظ على تعبير مستقبل السيتوكين أو تحسينه في NeM & # x003c6. احتوت مجموعات AAM & # x003c6-up على مستقبل IL33 Il1rl1 (ST-2) والوحدة الفرعية لمستقبلات IL27 Il27ra (WSX-1) ، وكلاهما تم وصفهما سابقًا على أنهما AAM & # x003c6 مرتبط. تم أيضًا تضمين مجموعات 21،22 AAM & # x003c6-up جفرا 2 (مستقبل عائلة GDNF & # x003b1-2) ، يشارك في بقاء الخلايا العصبية والتمايز ، 23 ومستقبلات اللبتين (ليبر). اللبتين هو مادة دهنية تشارك في استتباب الطاقة مع تأثيرات واسعة ومتعددة الاتجاهات. لا يوجد دور موصوف للبتين في مناعة Th2 ومع ذلك ، فإن الضامة ليبر- تعبر الفئران التي تعاني من نقص في مستويات أعلى من السيتوكينات الالتهابية ، 24 مما يشير إلى احتمال أن يساهم مستقبل اللبتين في المظهر المضاد للالتهابات لـ AAM & # x003c6.

    فيما يتعلق بالسيتوكينات ، أنتجت WT-NeM & # x003c6 أكثر بكثير Il6, Wnt2، و بمب 6 من WT-ThioM & # x003c6 أو IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -NeM & # x003c6. بمب 6 متعدد الاتجاهات ، يحد من تكاثر الخلايا البائية 25 ويعزز إنتاج البلاعم IL6. 26 Wnt2 ليس له دور محدد في فسيولوجيا البلاعم ، على الرغم من تأثير Wnts على قرارات مصير الخلايا المناعية. 27 هكذا Wnt2 و بمب 6 تمثل المرشحين الجدد الواعدين للتحقيقات المستقبلية حول مناعة Th2.

    يوصف AAM & # x003c6 بأنه مضاد للالتهابات على نطاق واسع ، ويرجع ذلك جزئيًا إلى إنتاجهما لـ IL10. من المثير للدهشة ، في الإعداد المزمن لتجربتنا ، أن WT-NeM & # x003c6 لم ينتج أي IL10 (الجدول التكميلي 5). ومع ذلك ، احتوت مجموعات AAM & # x003c6-down على العديد من السيتوكينات المنشطة للالتهابات. من بين هؤلاء تنف, ليف, Il1b، و Il16. 28 & # x0201330 بالإضافة إلى التعبير عن عامل تنشيط البلاعم تنفس 9 31 والوحدة الفرعية IL27 و IL35 Ebi3 تم تخفيضها في AAM & # x003c6. باختصار ، أعرب AAM & # x003c6 عن مستويات أعلى من المؤثرات المناعية المرتبطة بتجنيد الحمضات والبقاء على قيد الحياة وانخفاض مستويات العديد من العوامل المسببة للالتهابات.

    تحليل مسار KEGG

    لتقييم ما إذا كانت التغيرات الأيضية في الضامة التي لوحظت سابقًا أثناء علاج IL4 في المختبر تحدث أيضًا في الجسم الحي ، قمنا بتطبيق تحليل إثراء مجموعة الجينات (GSEA) باستخدام قاعدة بيانات مسار KEGG جنبًا إلى جنب مع تعديلات لبيانات RNA-Seq (انظر الطرق التكميلية). من خلال النظر في التعبير النسبي لجميع الجينات ، بدلاً من جينات DE فقط ، يوفر GSEA مقياسًا حساسًا لتحديد الاختلافات في مسارات الإشارات الكيميائية الحيوية والخلايا.

    شلال التكميل والتخثر.

    بشكل غير متوقع ، كان شلال التكميل والتخثر (مسار KEGG mmu04610) هو المسار الأكثر تنظيمًا تفاضليًا بين WT-NeM & # x003c6 و WT-ThioM & # x003c6 (الجدول الإضافي 6). كانت الميزة الأكثر لفتًا للتعبير التكميلي في AAM & # x003c6 هي وفرة النسخ (الشكل 5). على سبيل المثال، ج 3 و ج 4 جذبت & # x0003e 100000 قراءة لكل منها ، مما يجعلها من بين أكثر النصوص المرتبطة بـ NeM & # x003c6 وفرة. أظهر NeM & # x003c6 تنظيمًا للجينات المعقدة C1q (C1qa, C1qb، و C1qc) ، والإفراط في التعبير عن مكونات مسار MBL ، وتحديداً FicolinA (اتحاد كرة القدم الأميركي), كنف، و Cfp (الشكل التكميلي 9). يشير هذا إلى دور النشاط التكميلي المعتمد على FicolinA في الاستجابة لعدوى الديدان الطفيلية.

    يتم التعبير عن المكونات التكميلية بكثرة بطريقة بديلة تعتمد على التنشيط. التعبير عن الجينات في سلسلة التكميل والتخثر (مسار KEGG mmu: 04610). للرجوع إليها ، يتم تضمين المتوسطات المئوية المتوسطة والتسعين للتعبير لجميع الجينات المعبر عنها (خطوط حمراء صلبة ومتقطعة ، على التوالي). بالإضافة إلى ذلك ، جينات العلامة المعبر عنها للغاية تشي 3 (YM-1) و ريتنلا (RELM & # x003b1) مدرجة كمرجع.

    التمثيل الغذائي للميتوكوندريا.

    كانت ثلاثة وعشرون من السبعة والعشرين مسارًا الأكثر تنظيمًا تفاضليًا بين WT-NeM & # x003c6 و WT-ThioM & # x003c6 عبارة عن مسار استقلابي (الشكل 10 التكميلي الجدول 6). لوحظ اتجاه مماثل بين WT-NeM & # x003c6 و IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -NeM & # x003c6 ، مما يدعم نموذجًا يكون فيه التحول في النمط الظاهري الأيضي ميزة أساسية للتنشيط البديل 4 (الشكل التكميلي 10). كان المسار الثاني الأكثر اضطرابًا في KEGG بين WT-NeM & # x003c6 و WT-ThioM & # x003c6 هو دورة حمض الكربوكسيل (TCA) (الجدول التكميلي 6). في الواقع ، تم التعبير عن غالبية جينات دورة TCA المعبر عنها بمستوى أعلى في WT-NeM & # x003c6 بالنسبة إلى كل من WT-ThioM & # x003c6 و IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -NeM & # x003c6 (الشكل 6 أ الشكل التكميلي 11). كما لوحظ نمط مماثل من التعبير الجيني للجينات المشاركة في الفسفرة المؤكسدة (الشكل 6 ب). مجتمعة ، تتوافق هذه النتائج مع الدراسات السابقة التي أظهرت أن IL4 يحث على توسيع حجرة الميتوكوندريا في الضامة في المختبر. 32

    AAM & # x003c6 تنظيم جينات دورة TCA للميتوكوندريا وإظهار دليل على النسخ المعتمد على PPAR في الجسم الحي. (أ) رسم تخطيطي لدورة TCA يُظهر جينات DE في WT-NeM & # x003c6 بالنسبة إلى WT-ThioM & # x003c6. يمثل الحد الأزرق حدودًا منظمة وأخرى صفراء خاضعة للتنظيم. بالإضافة إلى ذلك ، تشير علامة النجمة الحمراء إلى الجينات التي تم تنظيمها في WT-NeM & # x003c6 بالنسبة إلى IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -NeM & # x003c6. (ب) خريطة الحرارة تظهر التعبير النسبي لمكونات سلسلة نقل الإلكترون في الميتوكوندريا (ETC) بين WT-NeM & # x003c6 و IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -NeM & # x003c6 و WT-ThioM & # x003c6. يتم التعبير عن غالبية مكونات ETC بشكل كبير في WT-NeM & # x003c6. (C) تُظهر مستويات التعبير عن ترميز النصوص لـ PPAR & # x003b3 و PPAR & # x003b4 ، وبروتين المُنشّط PGC-1 & # x003b2 أن WT-NeM & # x003c6 تعبر عن مستويات عالية من PPAR & # x003b4 و PGC-1 & # x003b2 ، ولكن لا PPAR & # x003b3. (د) تأكيد دقة التنبؤ TSS. يوضح مخطط الكثافة المسافات من TSS المتوقعة لكل جين إلى أقرب مجموعة TSS مفسدة (متوسط ​​الانحراف المطلق = 32 نقطة أساس). (هـ) نماذج الإجماع لمواقع ربط عامل النسخ الثلاث الممثلة بشكل زائد في مناطق المروج المرتبطة بـ AAM & # x003c6 المحددة باستخدام البرسيم (ص & # x0003c .01) ، مقارنة بين مناطق المروج المرتبطة بـ AAM & # x003c6 (TSS & # x02212400 ، +100 نقطة أساس) مقابل مروجي البلاعم غير المرتبطة بـ AAM & # x003c6.

    تم وصف PPAR & # x003b3 و PGC-1 & # x003b2 ، وهما المنظمان الرئيسيان لعملية التمثيل الغذائي للميتوكوندريا ، على أنهما مطلوبان لتنشيط البلاعم البديل في المختبر. 12،32 وفقًا لذلك ، يمكن تفسير ملف التعريف الأيضي الذي نلاحظه من خلال نشاط النسخ لأفراد عائلة PPAR (PPAR & # x003b1 و PPAR & # x003b3 و PPAR & # x003b4). ومع ذلك ، خلال ب الملايو العدوى ، PPAR الخاصة بالضخامة PPAR & # x003b3 & # x02212 / & # x02212 لا تظهر الفئران أي ضعف في التنشيط البديل (D.R. ، بيانات غير منشورة ، أكتوبر 2009). علاوة على ذلك ، على الرغم من زيادة تعبير PGC-1 & # x003b2 بطريقة IL4R & # x003b1 وتعتمد على العدوى ، كانت مستويات PPAR & # x003b3 أقل بكثير في NeM & # x003c6 من ThioM & # x003c6 (الشكل 6 ج). لم يتم التعبير عن PPAR & # x003b1 بواسطة أي من مجموعات البلاعم المقايسة (الجدول التكميلي 5). تم الحفاظ على تعبير PPAR & # x003b4 فقط في NeM & # x003c6 ، ومع ذلك لم يتم تنظيمه (الشكل 6 ج). يشير هذا إلى أنه أثناء الإصابة بالديدان الطفيلية ، قد يعوض PPAR & # x003b4 ، إما جزئيًا أو كليًا ، عن انخفاض PPAR & # x003b3 في NeM & # x003c6. بدلاً من ذلك ، قد يحافظ النسخ المستقل عن PPAR على استقلاب الميتوكوندريا في NeM & # x003c6.

    تحديد TSS وتحليل منطقة المروج

    لمعالجة ما إذا كانت PPARs تسهل نسخ الجينات المعتمدة على IL4R & # x003b1 في الجسم الحي ، قمنا بتحليل مواقع ربط عامل النسخ (TFBS) في مروجي الجينات المرتبطة بـ AAM & # x003c6. قمنا بتطوير وتحسين طريقة لتحديد TSSs بدقة باستخدام بيانات RNA-Seq (الشكل 6 د للحصول على تفاصيل الطريقة والتحقق من الصحة ، انظر الطرق التكميلية). باختصار ، تم تحديد النصوص باستخدام Cufflinks و 33 و TSSs التي تم تحديدها بناءً على التعبير الجيني المتوقع وعمق قراءة التسلسل الملحوظ في كل موضع في الجين. تم الحصول على تسلسل المروج القريب (300 نقطة أساس في المنبع و 100 نقطة أساس في اتجاه مجرى النهر لكل TSS) من 7817 TSSs عالية الثقة وتم تحليلها من أجل TFBSs ذات التمثيل الزائد.

    لقد تحققنا من صحة طريقتنا من خلال تحديد TFBSs ذات التمثيل الزائد في المروجين لدينا بالنسبة إلى جميع مروجي الماوس باستخدام Clover ، ومقارنة المجموعة التي تم العثور عليها مع TFBSs المقيدة بنسب البلاعم التي حددها Hume et al. 35 في بياناتنا ، حددنا 54 نموذجًا كانت موجودة بشكل ملحوظ في كثير من الأحيان أكثر من المتوقع (ص & # x0003c .01). استخدم Hume et al 35 مكتبة مختلفة من أشكال TFBS وحددوا 27 نموذجًا مهمًا ، 23 منها كانت ممثلة في المكتبة التي استخدمناها. حدد تحليلنا 18 من هؤلاء (78٪) على أنهم ممثلون بشكل مفرط في مروجي البلاعم لدينا ، مما يعزز نتائج الدراسة السابقة ويؤكد دقة تنبؤاتنا.

    تم تصنيف المروجين وفقًا للخصائص التعبيرية للجينات الأم. حددنا 682 AAM & # x003c6 المرتبطون بالمروجون ، المستمدة من الجينات التي تم تنظيمها في WT-NeM & # x003c6 بالنسبة إلى كل من WT-ThioM & # x003c6 و IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -NeM & # x003c6. تم تصنيف المروجين والبالغ عددهم 7135 مروجًا كمروّجات عامة للبلاعم. قارنا المروجين المرتبطين بـ AAM & # x003c6 بالمجموعة العامة ، وحددنا 3 أشكال TFBS ذات تمثيل زائد: MZF1 و ZNF354c و PPARG: RXRA (المعروف أيضًا باسم عنصر استجابة PPAR [PPRE] الجدول 2 الشكل 6 هـ). استخدمنا مجموعة أدوات تحليل التسلسل التنظيمي 36 لحساب عدد مثيلات كل فكرة ضمن مجموعتنا المكونة من 682 مروجًا مرتبطًا بـ AAM & # x003c6 ووجدنا أن 113 (17٪) تحتوي على عناصر PPRE عالية الثقة. نظرًا لأن نماذج الإجماع MZF1_1-4 و ZNF354c قصيرة جدًا ، لم نتمكن من تحديدها عند حد الأهمية الافتراضي (ص & # x0003c .00001). تحدد ملاحظة PPRE الوفيرة والممثلة بشكل مفرط النسخ بوساطة PPAR كعنصر مهم في تنظيم النسخ المرتبط بـ AAM & # x003c6 في الجسم الحي.

    الجدول 2

    3 مصفوفات وزن الموضع ذات التمثيل الزائد إحصائيًا في المروجين المرتبط بـ AAM & # x003c6 بالنسبة إلى جميع مروجي البلاعم

    عزر جاسبرزهرة البرسيم ص
    تنسيق الزنك MZF1_1-4.000
    PPARG :: RXRA تنسيق الزنك.004
    تنسيق الزنك ZNF354C.006

    زهرة البرسيم ص تم تحديد القيمة عن طريق اختبار التقليب مع 1000 تكرار.

    تحليل وتقدير كمية eicosanoids المشتقة من NeM & # x003c6

    حدد GO و KEGG GSEA التعبير الجيني المعزز للميتوكوندريا والاستقلاب ، وتحديداً دورة TCA ، كعدوى وعمليات تعتمد على IL4R & # x003b1 (الشكل 6 أ-ب). تحليلنا لـ AAM & # x003c6 المرتبط رابطة الدول المستقلة- دعمت الميزات التنظيمية دورًا لمشاركة PPAR (الشكل 6 هـ). معًا ، تشير هذه بقوة إلى أن النسخ بوساطة PPAR هو مكون محرك للنمط الظاهري AAM & # x003c6 في الجسم الحي. تم وصف PPAR & # x003b3 والفسفرة المؤكسدة على أنها ضرورية للتنشيط البديل ، 4 لكن تعبير NeM & # x003c6 PPAR & # x003b3 كان منخفضًا (الشكل 6 ج). نظرًا لأن PPAR & # x003b4 يعزز خلية kupffer البديلة 37 وتنشيط الضامة للأنسجة الدهنية 38 ، افترضنا أنه قد يعوض PPAR & # x003b3 في NeM & # x003c6. عائلة PPAR هي عوامل نسخ تعتمد على الترابط. وبالتالي ، على الرغم من أن PPAR & # x003b4 لم يكن DE ، فقد اكتشفنا احتمال أن يؤدي توفر الترابط المتزايد إلى تعديل النسخ المعتمد على PPAR & # x003b4 في NeM & # x003c6.

    حدد تحليل مسار KEGG استقلاب حمض الأراكيدونيك (AA) ، وهو مصدر معروف لروابط PPAR ، كما تم تنظيمه في WT-NeM & # x003c6 (الجدول التكميلي 6). تشكل منتجات سلسلة إنزيم AA ، eicosanoids ، مجموعة متنوعة من الوسائط المسببة للالتهابات والمضادة للالتهابات ، بما في ذلك البروستاجلاندين ، الليكوترين ، والليوكسينات. تميزنا بمجموعة واسعة من هذه المركبات التي تنتجها NeM & # x003c6 و ThioM & # x003c6 باستخدام LC-MS / MS في تجربة مستقلة ومماثلة (تفتقر إلى مجموعة ثيوجليكولات IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212). تم قياس eicosanoids الفردية (للحصول على قائمة كاملة بالأنواع ، انظر الطرق التكميلية) في سائل غسيل البريتوني وخارج الجسم الحي في 12 ساعة من المزارع الضامة المنقاة من الالتزام. أظهرت الثقافات الحية السابقة أن NeM & # x003c6 أنتجت إيكوسانويدات أكثر بكثير من ThioM & # x003c6 (الشكل 7 أ) بغض النظر عن تعبير IL4R & # x003b1. لا يمكن أن يُعزى هذا إلى النشاط المعزز لإنزيمات فسفوليباز A2 المحررة لـ AA حيث تم التعبير عن نسخ Pla2 في ThioM & # x003c6 على مستوى مشابه لـ NeM & # x003c6 (الشكل التكميلي 12). يشير هذا إلى أن تأثيرات IL4R & # x003b1 المستقلة عن ب الملايو محرك AA هدم.

    توصيف eicosanoids المشتقة من AAM & # x003c6. (أ) القياس الكمي لمستقلبات حمض الأراكيدونيك (AA) في ثقافات مدتها 12 ساعة من الضامة المنقى (أعلى) وفي غسل البريتوني (أسفل). (ب) مؤامرة عشرات PCA للثقافات 12 ساعة من الضامة المنقى. (C) مؤامرة تحميل PCA للوحة B ، توضح كيف تساهم eicosanoids الفردية في المحورين الأساسي والثانوي (x و y ، على التوالي). (د) مخطط دائري يوضح الانهيار في إنتاج مستقلبات سيكلو أوكسيجيناز بين WT-NeM & # x003c6 و IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -NeM & # x003c6. (هـ) رسم تخطيطي لسلسلة AA المستنسخة باستخدام VANTED. المربعات المربعة ذات النص الأحمر تمثل الجينات والمربعات المستديرة بالنص الأسود ، والمستقلبات المقاسة. تشير الأسهم السوداء إلى تفاعلات أنزيمية وسهام حمراء وأكسدة تلقائية. قيم التعبير النسبي (المقيسة بحيث يكون المجموع على جميع الشروط الثلاثة = 1) تحت الجين / المستقلب المرتبط. WT ب الملايو (المربع الأيسر) IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 ب الملايو مزروع (في الوسط) ، و WT thioglycollate (يمين). (F-G) عشرات PCA ومؤامرة التحميل كما هو الحال في اللوحتين B و C للغسيل البريتوني.

    أظهر تحليل المكون الرئيسي (PCA) لمحات eicosanoid من الضامة المستزرعة أن مجموعات العلاج الثلاث شكلت مجموعات متميزة (الشكل 7 ب). أنتج IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -NeM & # x003c6 مستويات عالية من PGE المسببة للالتهابات2 ومستقلبات المصب التي تعزز التهاب المرحلة الحادة. تميزت 39 WT-NeM & # x003c6 بإنتاج 12/15-lipoxygenase & # x02013 المستقلبات HETE ، في الغالب 12-HETE (الشكل 7 ج). ومن المثير للاهتمام ، أن مشتقات Cox الأكثر وفرة في WT-NeM & # x003c6 كانت 6-keto-PGF1 & # x003b1، منتج الأكسدة التلقائية لـ PPAR & # x003b4 agonist prostacyclin (PGI2 39 الشكل 7 د).

    سمح لنا دمج الملامح الدهنية وبيانات التعبير الجيني بفهم أفضل للعلاقة بين ملفات تعريف النسخ والنمط الظاهري الأيضي. لقد رسمنا بيانات التعبير الجيني وبيانات المستقلب على خريطة مسار السلسلة الأنزيمية ، التي تربط هدم AA بإنتاج المستقلب. أظهرت التعديلات في التعبير الجيني سينثيز توافقًا كبيرًا مع الوفرة النسبية لمستقلبات الابنة (الشكل 7 هـ) ، مع استثناء واحد ملحوظ. على الرغم من التعبير القوي عن Gpx1, ألوكس 5، و لتاعه، لم نتمكن من اكتشاف أي مستقلبات مشتقة من 5 ليبوكسيجيناز ، 5-HETE 5-OxoETE ، LTB4، أو 20-OH LTB4 (الشكل التكميلي 13). وهكذا تم تحضير الضامة البريتونية لإنتاج الليكوترينات لكنها لم تفعل ذلك. قد تفسر المنافسة الركيزة للحصول على AA أو مستوى أعلى من التحكم في تخليق الليكوترين الحيوي هذه الملاحظة. باختصار ، يتم تحفيز إنتاج eicosanoid بواسطة البلاعم استجابةً لـ ب الملايو. بدلاً من التأثير على إجمالي إنتاج eicosanoid ، قامت الإشارات المعتمدة على IL4R & # x003b1 بتعديل بنية الشلال الأنزيمي في اتجاه مجرى النهر ، مما أدى إلى ظهور صورة إيكوزانويد أكثر مقاومة للالتهابات.

    تساهم التفاعلات غير المتجانسة في ملف تعريف eicosanoid في الجسم الحي. لتمييز المساهمات النسبية للإيكوسانويدات المشتقة من البلاعم وغير & # x02013 ، قمنا بقياس منتجات AA في غسل البريتوني من الفئران في نفس التجربة (الشكل التكميلي 13). لم تظهر مخططات PCA (الشكل 7 F) أي تمييز بين WT thioglycollate-injection و IL4R & # x003b1 & # x02212 / & # x02212 -ب الملايو& # x02013implanted الفئران. ال WT ب الملايو& # x02013 الأشخاص المزروعون يتجمعون بشكل واضح ، مما يدل على أن الاستجابة لـ ب الملايو أدى الانغراس إلى إنشاء بيئة eicosanoid تعتمد على IL4R & # x003b1. هذا يعني أيضا أن ب الملايو ليس مصدرًا رئيسيًا لإجمالي eicosanoids البريتوني في هذا النموذج. زادت الفئران المزروعة بالـ WT HETE و PGD2و TxB2 التركيزات (الشكل 7 ز) ، 2 الأخير منها عبارة عن جاذبات كيميائية الحمضات. 42،43 من غير المحتمل أن يكون التشخيص الوراثي قبل الزرع2 مشتق من البلاعم حيث تم إنتاج مستويات منخفضة في مزارع AAM & # x003c6 خارج الجسم الحي. TxB2 ترتبط التركيزات ، ويمكن تفسيرها ، بالزيادة في أعداد البلاعم المرتبطة بالعدوى في بيئة WT (الشكل التكميلي 14A-B). لذلك حددنا ملف تعريف مستجيب دهني مميزًا في الاستجابة لعدوى الديدان الطفيلية. على الرغم من أن نشاط 5-lipoxygenase لم يساهم في هذا الملف الشخصي ، إلا أن تصرفات انزيمات الأكسدة الحلقية و 12/15-lipoxygenase فعلت ذلك.


    S.D. و S.A.S. و V.A. و G.G. و M.L. و M.H. صمم البحث ، S.D. ، S.A. ، N.H. ، و S.A.S. أجرى التجارب ، S.D. ، X.L. ، S.A.S. ، A.R.F ، V.A. ، G.G. ، V.M. ، M.L. ، and M.H. أجرى تحليل البيانات و S.D. و X.L. و M.L. و MH و S.A.S. كتب المخطوطة. راجع جميع المؤلفين المخطوطة.

    سيتم مشاركة البيانات التي تدعم نتائج هذه الدراسة عند النشر. سيتم إيداع بيانات RNA-Seq و Chip-seq في أرشيف قراءة التسلسل.

    اسم الملف وصف
    mmi14667-sup-0001-FigS1-S4.pdf مستند PDF ، 645.1 كيلوبايت الشكل S1-S4
    mmi14667-sup-0002-TableS1.xlsapplication / excel ، 626.5 كيلوبايت الجدول S1
    mmi14667-sup-0003-TableS2.xlsxapplication / excel ، 15.4 كيلوبايت الجدول S2
    mmi14667-sup-0004-TableS3.xlsxapplication / excel ، 10.3 كيلوبايت الجدول S3

    يرجى ملاحظة ما يلي: الناشر غير مسؤول عن محتوى أو وظيفة أي معلومات داعمة مقدمة من المؤلفين. يجب توجيه أي استفسارات (بخلاف المحتوى المفقود) إلى المؤلف المقابل للمقالة.


    شاهد الفيديو: 2020 - متي يكون تحليل الاصابة بـ فيروس الأيدز مؤكدا وقطعيا (أغسطس 2022).