معلومة

ما هو الفرق بين متوسط ​​وحسابات الكتلة أحادية النظير للببتيدات؟

ما هو الفرق بين متوسط ​​وحسابات الكتلة أحادية النظير للببتيدات؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

غالبًا ما يتعين علي حساب كتلة متواليات الببتيد باستخدام الآلات الحاسبة مثل هنا.

لدي خيار حساب الكتلة المتوسطة وحيدة النظير ، لكن ما هو الفرق؟


يمكن أن توجد العناصر التي تشكل عادة الببتيدات والبروتينات في نظائر مختلفة. على سبيل المثال ، يوجد الكربون بنسبة 98.9٪ كـ $ ce {^ 12C} $ و 1.1٪ كـ $ ce {^ 13C} $.

تفترض الكتلة أحادية النظير أن كل عنصر موجود في أكثر النظائر وفرة ، ويستخدم متوسط ​​الكتلة التوزيع الفعلي للنظائر في الطبيعة.

إذا كان لديك دقة كافية في الطيف الكتلي الخاص بك ، يمكنك رؤية إشارات متعددة تتوافق مع التركيبات النظيرية المختلفة للجزيء الخاص بك.


برنامج UNM الشامل للطيف الكتلي

يتم إجراء قياس الطيف الكتلي للتأين بالرش الكهربائي (ESMS) على مطياف الكتلة Micromass Q-Tof على عينات ذات أوزان جزيئية من 100 إلى أكثر من 100000 (مزيد من المعلومات). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضًا تحليل العديد من الأنواع الأخرى من العينات (مثل الكربوهيدرات والدهون والبوليمرات) على Q-Tof.

من المهم أيضًا ملاحظة أن متوسط ​​دقة الكتلة الواردة أدناه تم تقديره وأن الخطأ الجماعي في أي عينة معينة قد يكون أعلى أو أقل من هذه التقديرات. يجب استخدام الكتل أحادية النظير للجزيئات التي تقل كتلتها عن 3 كيلو دالتون بينما يجب استخدام متوسط ​​الكتلة للجزيئات الأكبر.


ما هو الفرق بين متوسط ​​وحسابات الكتلة أحادية النظير للببتيدات؟ - مادة الاحياء

يوفر هذا المستند إرشادات حول MS-Fit.

كان MS-Fit هو أول برنامج طوره كارل كلاوزر وبيتر بيكر معًا. ينبع الاسم من الاستخدام المتوقع للبرنامج: correlating مالحمار سبيانات قياس الطيف (الكتل الأم فقط ، وليس الكتل الشظية) مع بروتين في قاعدة بيانات تسلسلية وهو الأفضل لائق بدنياق البيانات. لاحظ أنه تم اختيار الكلمة المناسبة وليس تعريف الكلمة. في ربيع عام 1995 ، عندما تم اختيار الاسم ، كانت تجربة البصمة النموذجية لكتلة الببتيد التي سبقت استخدام MS-Fit هي هضم بروتين مع إنزيم ، ثم إجراء مطياف الكتلة MALDI على خليط الببتيدات الناتج لتحديد كتل كل منها الببتيد. في ذلك الوقت كانت دقة الكتلة الحديثة باستخدام MALDI على أداة وقت الطيران العاكس للاستخراج المستمر +/- 0.5 دا. كان مستوى دقة الكتلة هذا ضعيفًا مقارنةً بمعيار +/- 10 جزء في المليون الذي تم إنشاؤه باستخدام أدوات القطاع المغناطيسي قبل عدة عقود. وبالتالي ، في رأينا ، يمكن لـ MS-Fit في الحالات المواتية (حيث كان كلا النوعين والوزن الجزيئي التقريبي للبروتين السليم معروفين) فقط تشير إلى هوية البروتين. إلى إنشاء هوية البروتين يحتاج المرء ، في رأينا ، إلى بعض دعم التسلسل. يمكن الحصول على هذا الدعم من الاستخدام المشترك لـ MS / MS وبرنامجنا المطور لاحقًا.

أدى تطوير الاستخراج المتأخر MALDI في عام 1996 إلى تحسين دقة قياس الكتلة بشكل كبير على أدوات MALDI-TOF العاكسة. دقة الكتلة في حدود 5-100 جزء في المليون ممكنة الآن. يمكن الوصول إلى النهاية المنخفضة من هذا النطاق (أفضل دقة للكتلة) من خلال المعايرة الداخلية وأنابيب الطيران الطويلة ، بينما يمكن الوصول إلى الطرف الأعلى من النطاق بالمعايرة الخارجية وأنابيب الطيران القصيرة.

وبالتالي ، يمكن الآن التعرف على البروتينات بثقة عن طريق أخذ بصمات كتلة الببتيد باستخدام الكتل وحدها مع MS-Fit. اليقين في تحديد الهوية هو في المقام الأول دالة على مستوى دقة الكتلة.

يؤدي تحديد أي وضع بحث باستثناء الهوية إلى وضع MS-Fit في وضع التماثل من خلال استدعاء روتين مصفوفة طفرة MS-Tag. في هذا الوضع يتم تجاوز إجراءات MS-Fit للتعديلات الممكنة. بدلاً من ذلك ، يتم استخدام مجموعة AA المعدلة المسموح بها في وضع MS-Tag Homology.

في الممارسة العملية ، يجب استخدام وضع التماثل فقط عندما ينطبق واحد أو أكثر من الشروط التالية:

  • تحتوي بيانات كتلة الببتيد على دقة كتلة ممتازة (+/- 10 جزء في المليون أو أفضل)
  • يتم استخدام مرشح MW بروتين سليم سليم
  • سيتم حفظ الفعالية والبحث فيها عبر MS-Tag

يطابق MS-Fit تسلسل قاعدة البيانات مع كتلة الببتيد المحسوبة التي تمر عبر أحد مرشحات كتلة الببتيد. عادةً ما يتم تحديد المرشحات بواسطة كتل الببتيد التي يوفرها المستخدم +/- تحمل كتلة الببتيد (مرشح قياسي). في وضع Homology ، تتم إعادة تكوين هذه المرشحات لكتل ​​الببتيد التي يوفرها المستخدم +/- التحول الشامل للببتيد (انظر قسم دليل MS-Tag حول التحول الشامل للكتلة الأصلية للحصول على التفاصيل الكاملة). ومع ذلك ، لا يخضع إدخال بروتين معين في قاعدة البيانات لمرشحات التماثل الموسعة هذه إلا إذا تطابق عدد القطع الأولي لكتل ​​الببتيد التي يوفرها المستخدم لأول مرة في بحث مرشح قياسي. يتم التحكم في هذا القطع الأولي بواسطة المعلمة: دقيقة. # يتطابق مع عدم وجود استبدالات AA.

يتم بعد ذلك تمرير تسلسلات قاعدة البيانات التي تمر بمرشح كتلة الببتيد الموسع المتماثل عبر مصفوفة طفرة لمحاولة العثور على بديل AA واحد والذي من شأنه تحويل الكتلة المحسوبة لتسلسل قاعدة البيانات إلى الكتلة المحددة تجريبياً. يعرض الإخراج الاستبدال الضروري والتسلسل المقابل المتوافق مع بيانات كتلة الببتيد التجريبية (وليس التسلسل الموجود في قاعدة البيانات).

هذا يحدد كيفية التعامل مع البروتينات المتماثلة. الافتراضي هو "مثير للاهتمام" مما يعني أنه سيتم الإبلاغ عن بروتين متماثل فقط إذا كان هناك ببتيد فريد واحد على الأقل مطابق للبروتين. من حين لآخر ، سيتم الإبلاغ عن البروتينات على أنها متجانسة عندما يكون مستوى التماثل منخفضًا إلى حد ما (على سبيل المثال ، اثنان فقط من كل عشرة ببتيدات متطابقة بين البروتينات).

من أجل بروتين معين في قاعدة البيانات لتوليد نتيجة ، يجب أن يتطابق على الأقل الحد الأدنى من عدد الببتيدات المطلوبة للمطابقة الجماهير من بيانات الإدخال.

تعتمد درجة MOWSE التي أبلغ عنها MS-Fit على نظام التسجيل الموضح في Pappin et al ، Current Biology ، 1993 ، المجلد 3 ، رقم 6 ، ص 327-. نظرًا لأن MS-Fit يوفر العديد من الخيارات غير المتاحة في الإصدار الأولي من MOWSE ، فقد تم إجراء العديد من التعديلات.

بعد البحث المسبق عن الأنواع والوزن الجزيئي ، تخضع البروتينات المتبقية لعملية الهضم النظري. يتم بعد ذلك وضع الببتيدات الناتجة في صناديق بناءً على وزنها الجزيئي والوزن الجزيئي السليم للبروتين غير المهضوم الذي نشأت منه. هناك 11 حاوية وزن جزيئي سليمة. تحت 100000 دا يوجد 10 صناديق بعرض 10000 دا. تحتوي الحاوية الأخرى على جميع البروتينات التي تزيد عن 100000 دا. وهناك ثلاثون حاوية ببتيد للوزن الجزيئي بعرض 100 وحدة دولية بين 0-3000 دا ببتيدات فوق 3000 دا غير مرصوصة. تساهم الببتيدات التي لا تحتوي على انشقاقات مفقودة بمقدار 1.0 في إجمالي الصندوق بينما تساهم الببتيدات التي تحتوي على انشقاقات مفقودة فاكتور (معلمة قدمها المستخدم).

يتم بعد ذلك حساب قيم تردد الحاوية عن طريق قسمة إجماليات الحاوية على مجموع مجاميع الحاوية لكل فاصل زمني لبروتين Da 10000. ثم يتم معايرة قيم تردد الحاوية إلى أكبر قيمة تردد للحاوية لإعطاء قيم تردد بين 0 و 1.

الكتل في الهضم النظري والتي تطابق الكتل في مجموعة البيانات مقسمة إلى مباريات مسجلة ومباريات غير مسجلة. تتضمن مباريات التهديف الببتيدات غير المعدلة و Cys المعدلة من مادة الأكريلاميد و N-terminal Gln إلى pyroGlu وأكسدة Met في وجود الببتيد غير المعدل. تشتمل المطابقات غير المسجلة على pyroGlu وأكسدة Met في حالة عدم وجود الببتيد غير المعدل والأسيتيل N-termini وفسفرة S و T و Y وبدائل الأحماض الأمينية الأحادية. يتم تجاهل الجماهير التي لا مثيل لها. يتم تعيين درجة كل كتلة مطابقة على أنها قيمة تردد التوزيع المقيسة المناسبة. في حالة تعدد الكتل المطابقة ، يتم ضرب الدرجات معًا. يتم عكس درجة المنتج النهائية وتوحيدها إلى متوسط ​​وزن جزيئي للبروتين يبلغ 50 كيلو دالتون.

في حالة عدم تحديد التسجيل ، يستخدم MS-Fit نظام تصنيف بسيطًا. يتم فرز النتائج بحيث إذا تمت مطابقة إدخالات قاعدة البيانات المتعددة ، فسيتم إدراج التسلسلات الأكثر احتمالية أعلى في القائمة. يتم ترتيب جميع إدخالات قاعدة البيانات المطابقة لبيانات الإدخال والمعلمات على الأساس التالي:

  1. يتم ترتيب إدخالات قاعدة البيانات التي تحتوي على أقل عدد من الكتل التي لا مثيل لها في المرتبة الأعلى.
  2. من بين المطابقات المتكافئة (تلك التي لها نفس المرتبة) يتم فرز النتائج حسب زيادة رقم المؤشر.

لاحظ أن النوع الأخير يفعل ليس يعني ضمنا أ أفضل الترتيب ، على الرغم من أن إحدى المطابقات سيتم إدراجها في مرتبة أعلى من الأخرى ، ولكن الغرض منها فقط هو توفير منظمة معينة في القائمة.

يتم التعامل مع مضاعفة الأيونات المشحونة بطريقة مماثلة في جميع برامج Protein Prospector.

يمكن الآن تعيين إشارات أحادية النظير / متوسط ​​الأعلام في عمود على يمين عمود الكتلة / الشحن. يجب عليك أولا تعيين كتل الببتيد هي: إلى أحادي النظير ثم أدخل عمودًا من 0 و 1 هنا لتحديد ما إذا كانت قيمة m / z أحادية النظير (0) أو متوسطة (1). يجب أن يكون هناك نفس عدد 0/1 حيث توجد قيم m / z. إذا تُرك العمود فارغًا ، فمن المفترض أن تكون جميع القيم أحادية النظير كما كان من قبل.

هذا الخيار متاح حاليًا فقط للمرخص لهم. عادةً ما يتم التعليق على العناصر المناسبة في صفحة إدخال MS-Fit HTML.

في نهاية كل نتيجة في التقرير التفصيلي لـ MS-Fit ، يوجد ارتباط يسمح لك بإجراء بحث لاحق فقط باستخدام الكتل التي لا مثيل لها. تستخدم عمليات البحث اللاحقة نفس نسبة الكتل المقدمة إلى الكتل المطلوبة للمطابقة كما تم استخدامها في البحث الأصلي.

في نهاية كل إصابة في التقرير التفصيلي MS-Fit ، توجد قائمة بالجماهير التي لا مثيل لها. إذا قمت بالنقر فوق إحدى هذه الكتل ، يمكنك معرفة ما إذا كانت الكتلة تتطابق مع أي ببتيدات في البروتين الذي تم ضربه. لا تؤخذ في الاعتبار قواعد الانقسام المعتادة.

تتم طباعة النسبة المئوية لـ TIC والخطأ المتوسط ​​والتسامح مع البيانات ومتوسط ​​عدد الانقسامات المفقودة بعد إصابة MS-Fit. إذا لم يتم تحديد الشدة ، فستكون قيمة TIC المئوية هي نفسها النسبة المئوية للكتل المطابقة. يُفيد متوسط ​​الخطأ في تشخيص الأخطاء المنهجية في النتائج - مما يشير إلى وجود مشكلة في المعايرة. يكون تحمل البيانات ضعف الانحراف المعياري للنتائج وهو الرقم الذي يجب استخدامه كمعامل تفاوت في حالة عدم وجود أخطاء منهجية. يكون هذا الرقم أكثر موثوقية إذا كان هناك عدد معقول من القمم المطابقة (لنقل 10). كما أن الرقم يكون صالحًا فقط إذا كانت جميع الببتيدات المتطابقة هي نتائج حقيقية.


دقة الكتلة والقرار

زيادة وقياس دقة الكتلة و الدقة هي الآن أداة مهيمنة للتوصيف البنيوي في تطبيقات مختلفة تتجاوز الاكتشاف المبكر للعقاقير. نظرًا لامتدادها الواسع للخصوصية والمنفعة ، فإن أدوات وقت الرحلة الرباعية (QTOF) ، التي يقدمها عدد من الشركات المصنعة اليوم ، تحل محل تقنيات LCMS الأخرى.

على الرغم من وجود أدوات ذات ترتيب أعلى ، فإن دقة الكتلة العالية لأداة QTOF تقع ضمن بضعة أجزاء في المليون من القيمة الحقيقية ، المحسوبة ، أحادية النظير ، ودقتها العالية - التي تصل إلى 10 مرات أعلى من الأداة الرباعية - تسمح لنا بتحديد تجريبي الصيغ وفقًا لعيب الكتلة (حيث تعمل قيمة الكتلة الحرجة للهيدروجين والذرات الأخرى كعامل تفاضل). تحليل الأنواع- يصبح تمييز الفرق بين الألدهيد والكبريتيد ، على سبيل المثال - ممكنًا مع زيادة دقة الكتلة فوق الحدود الرباعية إلى 30 جزء في المليون ، حيث تختلف الكتلتان بمقدار 0.035 دا. ومع ذلك ، فإن التفريق بين عمليات التمثيل الغذائي التي تنطوي على مثيلة هو أكثر تطلبًا. مضيفا CH2 ينتج زيادة على السلائف (استجابة الدواء وحده) في الكتلة المقاسة +14.0157 Da ، مقارنةً بالتحول الأحيائي على مرحلتين الذي يتضمن الهيدروكسيل (إضافة الأكسجين) متبوعًا بالأكسدة عند رابطة مزدوجة (فقدان H2) ، والذي ينتج عنه زيادة قدرها +13.9792 Da. ومع ذلك ، فإن كلا القياسين ، عند تقييدهما بدقة اسمية - استجابة نموذجية رباعية الأضلاع - سيبدو +14 دا.

دقة الكتلة العالية والدقة المنخفضة

أدوات رباعية منخفضة الدقة يؤدي أداءً جيدًا للقياسات عالية الدقة للغاية ، مثل تلك المستخدمة في تحليل البروتينات. تُعرَّف كتل البروتينات عمومًا على أنها قيم "متوسطة" عندما لا يتم حل قمم النظائر بالنسبة إلى بعضها البعض. متوسط ​​الكتلة هو المتوسط ​​المرجح لجميع الأنواع النظيرية في الجزيء. يوسع الدقة الآلية المستخدمة عادةً في الأدوات الرباعية الاستجابة المحسومة لبروتين 10 كيلو دالتون بمعامل x1.27. يزداد هذا العامل بشكل كبير مع زيادة الكتلة (على سبيل المثال ، إلى x2.65 عند 100 كيلو دالتون). ومع ذلك ، عن طريق تقليل عرض الذروة إلى م / ض 0.25 (زيادة الدقة إلى دقة 4000) بدلاً من قصر دقة الجهاز على 1000 باستخدام عرض الذروة النموذجي (م / ض 0.6) يحسن الوضع بشكل كبير.

من الناحية العملية ، تنتج تحليلات ESI-MS للجزيئات الكبيرة أيونات مشحونة مضاعفة. ومن ثم يجب قسمة العروض على عدد الشحنات الموجودة على أيون لإعطاء العرض على مقياس نسبة الكتلة إلى الشحنة. على سبيل المثال ، ينتج بروتين 20 كيلو دالتون مع 10 أو 20 شحنة مغلفات نظيرية تبلغ 0.9 أو 0.45 م / ض وحدات واسعة في م / ض

عندما يتم ملاحظة هذه الأيونات على أداة محددة بدقة أقل بكثير من تلك المطلوبة لحل النظائر (على سبيل المثال أقل من 10000 دقة) ، يتم إنتاج ذروة واحدة لكل حالة شحن. يتم تحديد العرض الإجمالي من خلال الجمع بين عرض ذروة الجهاز والعرض النظري للغلاف النظيري مقسومًا على عدد الشحنات على الأيون. سيتم تحديد عرض الذروة الآلي على الذروة النظيرية الأولى لمركب منخفض الوزن الجزيئي في نفس الوقت م / ض القيمة باعتبارها ذروة البروتين المشحونة المضاعفة.

ما مقدار الدقة التي نحتاجها ، أو التي يمكننا تحقيقها بشكل واقعي ، وما هي الحلول الوسط؟

ضع في اعتبارك متطلبات التوصيف الذي لا لبس فيه من إرشادات مؤلفي Journal of the American Society for Mass Spectrometry (مارس 2004). لتركيبات C ، H ، O ، N (C0-100، ح3-74يا0-4 ون0-4) تحتاج الاستجابة الاسمية للكتلة إلى الشحن عند 118 إلى خطأ لا يتجاوز 34 جزء في المليون ليكون واضحًا ، حيث أ م / ض تتطلب الاستجابة عند 750 دقة أفضل من 0.018 جزء في المليون للتخلص من "جميع الاحتمالات الدخيلة".

تأثير زيادة دقة الكتلة لتحديد لا لبس فيه للمركبات (Quenzer ، TL ، Robinson ، JM ، Bolanios ، B. ، Milgram ، E. and Greig ، MJ ، تحليل آلي دقيق للكتلة باستخدام مطياف الكتلة FTICR ، وقائع المؤتمر السنوي الخمسين بشأن قياس الطيف الكتلي وموضوعات الحلفاء ، أورلاندو ، فلوريدا ، 2002).

زيادة التصفية أو تقييد الخطأ في القياس يقلل المرشحين المحتملين لنتيجة معينة

مقارنة الدقة من أداة إلى أخرى: وحدات الميليماس (mmu) ، وخطأ القياس (جزء في المليون) ، والدقة

وفقًا لـ Accurate Mass Best Practice Guide الخاص ببرنامج VIMMS ، وهي مبادرة تشكل جزءًا من نظام القياس الوطني في المملكة المتحدة ، فإن معظم الأدوات المستخدمة في قياسات الكتلة الدقيقة قادرة على تحقيق دقة تصل إلى 10 جزء في المليون أو أفضل.

ستعرض الكتلة المحسوبة البالغة 118 دا التي تم قياسها بواسطة مطياف الكتلة الحديثة بدقة تصل إلى 2 ملي ميكرومتر خطأ 17 جزء في المليون ، وهو ما يكفي وفقًا لمعايير اليوم لتحديد صيغة كيميائية لتلك الكتلة بشكل لا لبس فيه:

الكتلة الدقيقة المحسوبة أحادية النظير = 118 دا

الكتلة الدقيقة المقاسة = 118.002 Da

خطأ [الفرق / الكتلة الدقيقة × 106] = 17 جزء في المليون

ستكون الأداة القادرة على الاستجابة عند 750 م / ض ، والتي تعاني أيضًا من نقص بمقدار 2 مم ، دقيقة حتى 2.7 جزء في المليون. في الحالة الأولى ، يكون القياس أكثر من كافٍ لتحديد لا لبس فيه للصيغة الكيميائية ، وفقًا للمعايير المنشورة لمجلة The American Society for Mass Spectrometry. لكن في الحالة الأخيرة ، يكون القياس غير دقيق بشكل كافٍ. يمكن فقط لمطياف الكتلة الطيفي الكتلي لتحويل فورييه الأيوني (FTICR) أن يحقق هذه الدقة عند الكتل الأعلى.

طريقة شاملة لتقييم قدرة قياس دقة الكتلة للأداة والتي تشبه الاستخدام المقصود هي عن طريق حساب جذر متوسط ​​التربيع أو خطأ RMS. لتوضيح استخدامه ، تم تكييف ما يلي من مواصفات دقة قياس الكتلة لمقياس طيف الكتلة التجاري TOF.

& # 34 دقة قياس الكتلة للجهاز ، تحت ظروف التشغيل العاديةسيكون أفضل من a جزء في المليون RMS على المعطى نطاق م / ض، على أساس عدد من المتتالية كرر القياسات من ذروة الحليلة (من معين م / ض) ، باستخدام ذروة مرجعية مناسبة (من معين م / ض). يجب أن يكون للتحليل والذروات المرجعية كثافة كافية وخالية من التداخل من الكتل الأخرى. & # 34

هناك بعض النقاط والافتراضات الهامة التي يجب أخذها في الاعتبار:

  1. ان معايرة الصك تم إجراؤه بالفعل بقمم كتلة معروفة باستخدام معيار معايرة. تُستخدم الذروة المرجعية لحساب أي تغير في معايرة الأداة بمرور الوقت ويتم تحديد دقة قياس الكتلة باستخدام ذروة التحليل.
  2. ظروف التشغيل العادية - يمكن أن تتضمن أيضًا تفاصيل الظروف الكروماتوغرافية (لمواصفات أداء LC / MS) وأي ظروف تشغيل MS ذات صلة (مثل استبانة الكتلة ، أو m / z ذات الأهمية ، أو معدل الاستحواذ الطيفي).
  3. شدة كافية - يفترض أن عدد الأيونات لا يضر بتوصيف دقة (قياس الكتلة) ودقة الأداة المعنية. يؤدي عدد الأيونات القليل جدًا إلى إحصائيات أيونات ضعيفة ويمكن أن يؤدي عدد كبير جدًا من الأيونات إلى تشبع الكاشف ، وكلاهما يؤدي إلى تباين أكبر في الانحراف المعياري لقياسات التكرار وسيؤثر سلبًا على حساب خطأ RMS (يتعلق أيضًا بمعايرة الجهاز).
  4. خالية من التدخلات - يفترض أن قياس الكتلة لذروة الكتلة المعروفة خالٍ من التداخل بواسطة أيونات لها نفس الكتلة أو ذات كتلة مماثلة. تؤدي القمم المتداخلة إلى ضعف دقة قياس الكتلة مما يضر أيضًا بالتوصيف الصحيح لدقة أو دقة الأداة (ذات الصلة أيضًا بمعايرة الجهاز).
  5. ال المرجع هو أتمثيل جيد من النطاق m / z ذي الصلة بتحليل نوع عينة معين.

يتم حساب الخطأ RMS باستخدام العلاقة التالية ، حيث هجزء في المليون هو خطأ جزء في المليون ، و ن هو عدد الجماهير المعتبرة:

وتجدر الإشارة إلى أن خطأ RMS يسمح لبعض القياسات بأن تقع خارج "نافذة الاهتمام" لخطأ جزء في المليون (على سبيل المثال ، 5 جزء في المليون RMS). لضمان قياسات الجودة ، يجب تلبية الشروط الموضحة أعلاه (خاصة فيما يتعلق بكثافة وتأثير التداخلات - إحصائيات الأيونات المتوازنة مع تعريف ذروة واضح في الأطياف) على عدد من الحقن المتكررة. العديد من أرقام الدقة والكتلة المبلغ عنها التي تراها ليست أرقام أخطاء RMS ولكنها تنشأ بدلاً من ذلك من أيون واحد (مفضل) محدد.

من المهم أن تتذكر في جميع التطبيقات أن ملف إشارة ضعيفة (دقة عالية بشكل مفرط) يمكن أن ينتج عنه إحصائيات سيئة عن الأيونات وبالتالي يمكن أن يكون غير قابل للاستخدام. يمكن أن تكون الإشارة القوية جدًا عديمة الفائدة على حد سواء ، مما يتسبب في تشبع الكاشف. الهدف هو إحصائيات الأيونات المتوازنة بشكل مثالي مع التعريف في الأطياف.

بعض المقارنات فيما يتعلق بالشكل:

  • الدقة الرباعية ليست كافية للتمييز بين المركبين في الشكل العلوي.
  • مع قوة حل

من المهم تقدير الأدوار المختلفة المترابطة التي يتم لعبها بدقة جماعية دقيقة بواسطة التحول بين تعريفات الكتلة ويزداد الدقة وعوامل مثل شكل الذروة والحاجة إلى معايرة. إذا لم يتم فهم هذه الأمور بشكل واضح وأخذت في الاعتبار ، فقد تحدث التخصيصات الجماعية الخاطئة والنتائج غير المرغوب فيها الأخرى.

يوضح الشكل المتراكب استجابة رباعية الأضلاع واستجابة TOF حيث تكون قيمتا الكتلة في بيانات TOF ضمن 1mDa من الكتلة الدقيقة.

الجزءان من التراكيب المختلفة في الشكل مأخوذون من نفس التحليل وبالتالي في المصدر في نفس الوقت. حتى أفضل كروماتوغرافيا لن تساعد في هذه الحالة ، لذا فإن هذا يؤكد على أحد الأسباب التي تجعل الدقة العالية مفيدة خاصة في تحليل المجهول. ينطبق هذا بشكل جيد على بيانات أيون منتج QTof مقابل بيانات أيون المنتج من رباعي رباعي. كميزة إضافية مع هذه الدرجة العالية من الدقة ، يسمح مخطط التيار الأيوني المستخرج (XIC) لكل منها بالتمييز بين التحليلات المحتوية على الأكسجين والألكيل المحتوي بشكل انتقائي عن المخططات اللونية حيث تفتقر البيانات الرباعية إلى هذه القدرة.

    قرار المناظرة والدقة الجماهيرية ، المجلد. 22 رقم 2 ، 118-130 ، فبراير 2004
      سبب أهمية ذلك: يتعامل مع العديد من القضايا التي تقع في صميم الجوانب العملية للاستخدام بالإضافة إلى المقارنات من مصادر الصناعة

    • سبب أهمية ذلك: يناقش فائدة أدوات الدقة الأعلى ويقارنها بالتوقعات الواقعية.

      منهجية القياس الدقيق للكتلة للجزيئات الصغيرة، K. Webb ، T. Bristow ، M. Sargent ، B. Stein ، برنامج VIMMS التابع لوزارة التجارة والصناعة ضمن نظام القياس الوطني بالمملكة المتحدة ، (LGC Limited ، Teddington ، المملكة المتحدة 2004). وثيقة توجيه VIMMS 2004
        سبب أهمية ذلك: نظرة عامة موجزة وموجزة عن القضايا الحاسمة للنجاح في العمل الشامل المحسوب والدقيق.

      • لماذا هذا مهم: يتوسع في الموضوع الأساسي ليشمل عيب كتلة Kendrick ووسم الببتيدات والبروتينات.

      اسمى، صورى شكلى، بالاسم فقط كتلة الوحدة.

      سلفاميثازين الاسمي = 278

      متوسط ​​الكتلة محسوبة باستخدام جميع نظائر كل عنصر ووفرتها الطبيعية.

      سلفاميثازين متوسط. الكتلة = 278.3313

      الكتلة الدقيقة المحسوبة (أحادي النظارة). يتم تحديدها عن طريق جمع كتل النظائر الفردية لأيون معين.

      الكتلة الدقيقة للسلفاميثازين = 278.0837

      كتلة دقيقة (في الواقع "الكتلة الدقيقة المقاسة"). ماذا نفعل بأدواتنا. إنه مقياس م / ض يبلغ (عادةً) ثلاث أو أربع منازل عشرية.

      مع زيادة الكتلة ، تزداد الاختلافات بين التعريفات ، ويلعب شكل الذروة دورًا أكبر:

      متوسط ​​Ubiquitin الاسمي الدقيق

      الوحدة 16.1 ، نظرة عامة على تحليل الببتيد والبروتين بواسطة مطياف الكتلة، S. Carr and R. Annan، in Current Protocols in Protein Science، J. Wiley and Sons (1996)


      البروتيوميات ونواة قياس الطيف الكتلي

      مجموع درجات الأيونات لجميع الببتيدات التي تم تحديدها.

      عدد مباريات طيف الببتيد. عدد PSM هو العدد الإجمالي لأطياف الببتيد المحددة المطابقة للبروتين. قد تكون قيمة PSM أعلى من عدد الببتيدات المحددة للبروتينات عالية الدرجات لأنه يمكن تحديد الببتيدات بشكل متكرر.

      النسبة المئوية لتسلسل البروتين التي تغطيها الببتيدات المحددة.

      عدد البروتينات المحددة في مجموعة البروتين ، أي عدد البروتينات المعروضة في عرض أعضاء مجموعة البروتين.

      # الببتيدات الفريدة

      عدد سلاسل الببتيد الفريدة لمجموعة البروتين. هذه هي الببتيدات المشتركة في بروتينات مجموعة البروتين ، والتي لا تحدث في بروتينات أي مجموعة أخرى. يمكن تعيين عدد الببتيدات الفريدة التي تحدد مجموعة البروتين في Proteome Discoverer.

      العدد الإجمالي لتسلسلات الببتيد المتميزة المحددة في مجموعة البروتين.

      Xcorr (الارتباط المتبادل) هو مقياس لمدى ملاءمة شظايا الببتيد التجريبية للأطياف النظرية التي تم إنشاؤها من التسلسل b و y الأيونات.

      ارتباط دلتا هو مقياس لخصوصية الملاءمة. يصف مدى ملاءمة تسلسل المرشح الأساسي للبيانات التجريبية مقابل تسلسل المرشح الثانوي. يشير العدد الأصغر إلى ملاءمة أفضل.

      دلتا م (جزء في المليون)

      كتلة دلتا هي انحراف الكتلة المقاسة عن الكتلة النظرية للببتيد ، في جزء في المليون.

      قيمة q هي الحد الأدنى من معدل الاكتشاف الخاطئ الذي يعتبر التحديد صحيحًا.

      احتمال الخطأ الخلفي (PEP)

      احتمال الخطأ اللاحق (PEP) هو احتمال أن PSM المرصود غير صحيح.


      خيارات الوصول

      احصل على حق الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

      جميع الأسعار أسعار صافي.
      سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
      سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

      احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

      جميع الأسعار أسعار صافي.


      عصبي

      تمت كتابة NeuroPred للويب باستخدام Python (http://www.python.org) ويمكن الوصول إليه من http://neuroproteomics.scs.uiuc.edu/neuropred.html. الغرض الرئيسي من أداة NeuroPred هو التنبؤ بمواقع الانقسام لسلائف الببتيد العصبي باستخدام نماذج الانحدار اللوجستي المدربة على معلومات الانقسام التي تم التحقق منها تجريبياً. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن حساب مؤشرات دقة النموذج وكتل الببتيد العصبي من مواقع الانقسام المتوقعة.

      الإدخال المطلوب لـ NeuroPred هو تسلسل واحد أو أكثر ، يتم توفيره بتنسيق FASTA ، إما يتم إدخاله مباشرة في مربع نص على الصفحة ، أو تحميله عبر ملف نصي. تشمل خيارات المستخدم المتاحة "اختيار النموذج والمخرجات" و "خيارات النمذجة والحسابات الجماعية" و "التعديلات اللاحقة للترجمة" (الشكل 1).

      اختيار النموذج

      اختيار النموذج الافتراضي هو Known Motif (10) والنماذج الأخرى التي يمكن اختيارها هي Mollusk Basic و Mollusk Complex (11) و Mammalian (12) ونموذجان من الحشرات ، أحدهما مدرب باستخدام ألف ميليفيرا والآخر دي ميلانوجاستر المعلومات الجينية (B. R. Southey ، A.B Hummon ، T. A. Richmond ، S. L. Rodriguez-Zas and J. يمكن استخدام نماذج متعددة في وقت واحد للتنبؤ بالانقسام في نفس التسلسل. يتم توفير تفاصيل محددة حول النماذج المعنية ، بما في ذلك التدريب ومعلومات التسلسل والشروط النهائية ، بواسطة Hummon وآخرون . (11) ، عماري وآخرون . (12) و سوثي وآخرون . [(10) ، B. R. Southey ، A. B. Hummon ، T. A. Richmond ، S. L. Rodriguez-Zas and J. V. Sweedler ، المخطوطة المقدمة].

      اختيار الإخراج

      ضمن الخيار الافتراضي ، "توقع مواقع الانقسام فقط" ، سيتنبأ NeuroPred فقط بمواقع الانقسام عن طريق حساب احتمال الانقسام لكل تسلسل تم إدخاله لجميع النماذج المحددة. اكتملت هذه الخطوة لجميع خيارات الإخراج. بعد التنبؤ بمواقع الانقسام ، ستقوم NeuroPred إما بحساب إحصائيات دقة النموذج أو إجراء حسابات الكتلة ، وفقًا للخيارات المحددة.

      المعالجة

      قبل التنبؤ باحتمالية الانقسام ، تخضع جميع تسلسلات السلائف لسلسلة من خطوات المعالجة المسبقة ، الموصوفة بالتفصيل بواسطة Southey وآخرون . (B. R. Southey ، A.B Hummon ، T. A. Richmond ، S.L Rodriguez-Zas and J.V.Sweedler ، مخطوطة مقدمة). يتم تحديد حجم النافذة وموقع موقع الانقسام داخل النافذة من خلال النموذج المحدد ، حيث يتم النظر في إمكانية الانقسام فقط في الموقع الأساسي. مكونات المعالجة المسبقة التي يمكن تغييرها من قبل المستخدم هي طول إشارة الببتيد والحد الأدنى لعدد الأحماض الأمينية المحيطة بموقع الانقسام. يمكن تحديد طول إشارة الببتيد من قبل المستخدم ، ويصبح هذا الطول هو القيمة العامة المستخدمة لجميع متواليات السلائف. بدلاً من ذلك ، يمكن تضمين طول ببتيد الإشارة في ملصق FASTA لكل تسلسل ، والذي يتجاوز القيمة العامة وقد يختلف عبر التسلسلات. يشير فحص مجموعة واسعة من السلائف وهيكل الفورين (14) إلى أن الحد الأدنى من الأحماض الأمينية حول موقع الانقسام مطلوب لحدوث الانقسام ، وبالتالي فإن الحد الأدنى لعدد الأحماض الأمينية ، قبل موقع الانقسام وبعده ، يمكن يتم تحديدها أيضًا من قبل المستخدم.

      توقع الانقسام

      يتم التنبؤ بالانقسام عن طريق حساب احتمال الانقسام من الانحدار اللوجستي (15) أو نماذج Known Motif لكل موقع انقسام محتمل. تتم مقارنة الاحتمالية المتوقعة للانقسام مع عتبة محددة مسبقًا وتحويلها إلى تنبؤات انشقاق أو عدم انقسام. يتم عرض احتمالية حد افتراضية بنسبة 50٪ وفاصل ثقة افتراضي بنسبة 95٪ للمواقع التي يُتوقع قصها. يعكس فاصل الثقة غير المتماثل الطبيعة غير الغوسية للحدث المتوقع ومساحة المعلمة للاحتمالات بين 0 و 1 (15). يمكن تعديل كل من احتمالية العتبة وتغطية فاصل الثقة بواسطة المستخدم.

      ناتج الانقسام المتوقع

      عند تحديد الخيار الأساسي "توقع مواقع الانقسام فقط" ، يكون الناتج الناتج لكل سلائف رسمًا بيانيًا يتضمن التسلسل ومواقع الانقسام المتوقعة (على غرار الشكل 2). تشير مجموعات مواقع الأحماض الأمينية "C" أدناه إلى أن الاحتمال المتوقع للانقسام عند هذا الحمض الأميني تجاوز عتبة احتمالية الانقسام التي يحددها المستخدم. يتم عرض الاحتمالية المتوقعة للانقسام وما يرتبط بها من حدود فاصل الثقة 95٪ لتركيبات موقع الأحماض الأمينية التي يُتوقع أن تنقسم. يشار إلى باقي مجموعات مواقع الأحماض الأمينية بعلامة "." للإشارة إلى توقع غير مشقوق. عندما يتم تحديد نماذج متعددة ، يتم الإبلاغ عن مواقع الانقسام المتوقعة لكل نهج على نفس الرسم التخطيطي ، مما يتيح المقارنة المباشرة لمواقع الانقسام المتوقعة.

      إحصائيات دقة النموذج

      يمكن لـ NeuroPred أيضًا تقييم أداء النهج المختار. من خلال مقارنة الانقسامات المتوقعة مع معلومات الانقسام التي أدخلها المستخدم ، يتم توفير إحصائيات دقة النموذج لكل تسلسل سلائف فردي ، وعبر جميع تسلسلات السلائف التي تم إدخالها.

      يتم إنشاء إحصائيات الدقة هذه عن طريق تحديد خيار الإخراج ، "توقع مواقع الانقسام وحساب إحصائيات دقة النموذج". ستحسب NeuroPred إحصائيات دقة النموذج المختلفة بناءً على مواقع الانقسام المتوقعة ومعلومات الانقسام التي يوفرها المستخدم أو "المعروفة". يتم إدخال معلومات الانقسام المعروفة كسطر يتبع التسلسل حيث يشير "0" إلى عدم وجود انقسام بينما يشير "1" إلى الانقسام. لاحظ أنه عند تحديد خيار الإخراج هذا ، إذا لم يتم إدخال المعلومات المقدمة من المستخدم ، أو تم إدخالها بشكل غير صحيح ، فإن NeuroPred سيتنبأ بمواقع الانقسام ، لكنه لن يوفر إحصائيات الدقة.

      يشبه الإخراج من اختيار إحصائيات دقة النموذج ذلك الموجود في خيار "توقع مواقع الانقسام فقط" بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضًا تمثيل معلومات الانقسام التي أدخلها المستخدم في مخطط الإخراج (الشكل 2) للمساعدة في تصور ما هو صحيح وغير صحيح تنبؤات. يشار إلى مواقع الانقسام التي تتجاوز احتمالية العتبة المحددة على أنها تنبؤات صحيحة أو خاطئة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير حدود الاحتمال والثقة لمواقع الانقسام المعروفة التي لا تتجاوز احتمالية العتبة المحددة.

      يوفر خيار "توقع مواقع الانقسام وحساب إحصائيات دقة النموذج" إحصاءات دقة النموذج لكل سلائف ، وعبر جميع السلائف ، باستخدام احتمالات عتبة تتراوح من 0.1 إلى 0.9. لكل مقدمة ، يتم تقييم أداء النموذج باستخدام عدد تنبؤات الانقسام الصحيح (نتيجة إيجابية حقيقية) ، والانقسام غير الصحيح (نتيجة إيجابية خاطئة) ، وعدم الانقسام الصحيح (نتيجة سلبية حقيقية) ، وعدم الانقسام غير الصحيح (نتيجة سلبية خاطئة) عبر طول السلائف. ثم يتم تلخيص هذه القيم على جميع السلائف التي تم إدخالها. يتم تقييم مدى كفاية نهج نموذج الانقسام عبر جميع السلائف باستخدام الإحصائيات التالية:

      معدل التصنيف الصحيح: عدد المواقع المتوقعة بشكل صحيح مقسومًا على إجمالي عدد المواقع.

      الحساسية (واحد ناقص المعدل الإيجابي الخاطئ): عدد الإيجابيات الحقيقية مقسومًا على إجمالي عدد المواقع المشقوقة.

      الخصوصية (واحد مطروحًا منه معدل سلبي كاذب): عدد السلبيات الحقيقية مقسومًا على العدد الإجمالي للمواقع غير المقسمة.

      القدرة التنبؤية الإيجابية (نسبة المواقع التي يُتوقع أن تكون مشقوقة وإيجابيات حقيقية): عدد الإيجابيات الحقيقية مقسومًا على العدد الإجمالي للمواقع التي يُتوقع أن يتم شقها.

      Negative predictive power (proportion of sites that are not predicted to be cleaved that are true negatives): number of true negatives divided by the total number of sites predicted to not be cleaved.

      Correlation coefficient: Mathew's correlation coefficient ( 16 ) between observed and predicted cleavage.

      Area under the receiver operator characteristic or ROC curve relates sensitivity and 1-specificity ( 17 ). Area values lower than 0.7 indicate poor model performance.

      Peptide mass prediction

      The mass of predicted peptides for multiple precursors can be calculated by NeuroPred, where the masses of the peptides are calculated using common neuropeptide post-translational modifications. For applications using mass spectrometry, a list of the intermediate and final peptides and their associated masses offers more complete information about the precursor-derived peptides than a list of final peptide masses.

      The peptides are determined using the model results. Specifically, basic sites are predicted as non-cleaved when there is a consensus from the selected models for non-cleavage. The sequence, after removal of the specified signal peptide for each precursor, is cleaved at the remaining basic sites to provide peptides of different lengths. In order to account for any falsely predicted cleavages and different model predictions, the peptides that are adjacent in the sequence are joined (assuming that cleavage did not occur), and these additional masses are included in the output. This process of joining peptides can be extended up to, but not including, complete sequence after removal of the specified signal peptide.

      Options to control the output of the mass prediction include: the number of adjacent sites that can be joined, the range of mass sizes, and the maximum number of amino acids of a predicted peptide resulting from cleavage. The resulting peptides are then further processed using a variety of possible post-translational modifications—with the removal of terminal basic amino acids, amidation and pyroglutamination being selected by default. Other non-default modifications can be selected. The selected post-translational modifications are applied to each peptide where appropriate, resulting in additional peptides. The average and monoisotopic masses are calculated for every peptide.

      The output ( Figure 3 ) includes a list of peptides and the mass calculation table. The columns of the mass calculation table are the abbreviation of the sequence, the post-translational modifications applied to that sequence, the average and monoisotopic masses, and the full sequence. The user can sort the list of peptides by the combination of actual sequence location of the peptide and post-translational modification, or by either the average or monoisotopic mass.


      FYs 2013-2017 Regulatory Science Report: Complex Mixtures and Peptides

      Complex drug substances or complex active pharmaceutical ingredients (APIs) include peptides, heterogenous mixtures of small molecules, natural and synthetic polymers, and macromolecular complexes. Their compositional profile may not be easily characterized by current conventional methods and the active components may not be fully defined. Complex drug substances have become more common in approved pharmaceutical products in the past several years. In 2012, the peptide drug market in the United States was less than $11 billion and by 2016 it had grown to more than $18 billion. Complex drug substances are important in many different therapeutic areas and have been used to treat a wide range of conditions, from the use of conjugated estrogens for hormone replacement therapy in post-menopausal women to the use of liraglutide for the treatment of type II diabetes. Complex drug substances are identified in the Generic Drug User Fee Amendments reauthorization (GDUFA II) commitment letter as one of the categories of complex products that are eligible for the enhanced pre-abbreviated new drug application (ANDA) programs for complex products.

      Before the Generic Drug User Fee Amendments of 2012 (GDUFA I), research in complex drug substances was limited and focused on a narrow range of products such as synthetic salmon calcitonin and enoxaparin . Research on these products demonstrated that determining API sameness for complex molecules is feasible. In the case of synthetic salmon calcitonin, API sameness and comparability in product and process-related factors were identified as critically important for ensuring the comparability of immunogenicity between the proposed generic and reference listed drug (RLD) products. The approval of salmon calcitonin and enoxaparin became an important foundation for the approval of other generic products containing complex APIs.

      Complex active ingredients are diverse and may be mixed with a variety of inactive ingredients in a drug product and thus clear and properly defined API sameness criteria can accelerate the development of generic versions. For peptide drugs, while the active ingredient can be clearly defined and well characterized, characterizing the impurity profile of peptide-related substances and assessing the associated safety risks for things like immunogenicity, is challenging. For complex mixtures, identifying and characterizing active ingredients itself is a daunting task. Food and Drug Administration (FDA) research from the Office of Pharmaceutical Quality (OPQ) and the Office of Generic Drugs (OGD) has been focused on these areas for the past five years. Collectively, our research activities have advanced FDA’s understanding of complex drug products containing complex mixtures, helped establish product-specific guidance (PSG) on API sameness, and provided critical information for the regulatory review and decision-making processes.

      Through our research we have explored and applied modern analytical and quantitative methods to characterize product-specific attributes so that the sameness of the active ingredients can be established between RLDs and proposed generic drugs. During the first 5 years of GDUFA, FDA identified new analytical technologies and used them in the separation and characterization of complex API mixtures and impurities. This research has been performed both internally at the state-of-the-art OPQ laboratories and through external partnerships with academic institutions. For example, ion-mobility spectrometry mass spectrometry (IMS-MS) and complex two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy (2-D NMR) techniques, and separation and characterization of complex natural products were used in characterizing the complex API mixtures and providing a basis for demonstrating API sameness.

      FDA also conducted research in peptide impurity identification and characterization using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) to analyze calcitonin salmon nasal spray products from different manufacturers. FDA also studied immunogenicity potential of these peptide products in vitro using a cell-based assay. Computational algorithms, commonly referred to as big data analysis, based on LC-MS data acquired at FDA allowed FDA to identify key structural fingerprint information of glatiramer acetate, a mixture of synthetic peptides of varying lengths and sequences of four amino acids, creating a foundation for evaluating API sameness and generic drug approval. Internal research led to the approval of generic glatiramer acetate in 2015 and publication of the glatiramer acetate PSG in 2016. Through GDUFA-funded research, FDA published several new PSGs for complex API drugs, and revised many other PSGs to include API sameness. All these achievements were made possible with the GDUFA-funded research support.

      Research and Collaborations

      Integrated Approach to Determine Equivalence in Complex Drug Mixtures
      FDA awarded Grant 1U01FD005291 to Ram Sasisekharan at Massachusetts Institute of Technology on September 10, 2014, and the study was completed in August 2017. The grant aimed to characterize the complex drug pentosan polysulfate sodium (PPS) and use the information gathered in the characterization process to build mathematical models. This information can be used to predict the structures of the individual components and their relative abundances in the complex mixture. Researchers identified analytical technologies and implemented them at different levels based on heterogeneity of the APIs to provide orthogonal measurements on overlapping structural attributes of the API between each level the structural attributes obtained from those measurements were cross validated to make sure the variations in the attributes were captured in the measurements. The data were used to develop a model that describes the varying chemical compositions of the API and evaluate the sufficiency of API characterization and API sameness in composition.

      Development of an Integrated Mathematical Model for Comparative Characterization of Complex Molecules

      FDA awarded Grant 1U01FD005285 to David Volkin at the University of Kansas on September 10, 2014, and the study was completed in August 2017. The goal of this grant was to build a mathematical model using data collected in the characterization of complex molecules to assess the similarity and determine if the data were sufficient for API sameness evaluation. The active ingredient and its degradation products were studied with a variety of physicochemical and biological assays to characterize the critical quality attributes. All the data collected were used to develop a mathematical model which can be used to assess API sameness of generic drug applications.

      Statistical Methodology for Characterization of Macromolecular Similarity

      FDA awarded Grant 1U01FD005288 to John Cort at Battelle Pacific Northwest National Laboratories on September 10, 2014, and the study was completed in August 2017. The goal of this project was to develop a statistical methodology to assess macromolecular similarity of pentosan polysulfate (PPS). In this project, IMS-MS and 2D-NMR data were collected on PPS and these data were used to build PPS signatures. Similarity between two sets of data were measured and variability was captured with a subset of features so that sufficiency may be established through a similarity metric. The data collected were used to develop a macromolecular similarity model which can be used to assess similarity between different samples.

      Mass Spectrometry Profiling of Pentosan Polysulfate in Urine

      FDA awarded Contract HHSF223201610114C to John Cort at Battelle Pacific Northwest National Laboratories on September 22, 2016, and the project is ongoing. The goal of this project is to use MS to profile PPS and its metabolites in urine with the final goal of assisting with the development of a bioanalytical method to establish bioequivalence for PPS as an alternative to clinical endpoint bioequivalence studies. In this project, it was found that reverse phase ion-pair chromatography can separate PPS from salts, metabolites, and other small molecules in urine prior to analysis with a mass spectrometer. High resolution and accurate MS can help the identification and characterization of PPS components. Preliminary data show that urine samples from patients taking PPS have a different profile compared to urine samples spiked with PPS indicating PPS in patient urine is different from the original PPS.

      Characterization of Glatiramer Acetate

      Glatiramer acetate is a mixture of synthetic peptides containing four amino acids, glutamic acid, alanine, tyrosine, and lysine, with an average molecular weight of 5,000- 9,000 Daltons. FDA labs used the brand-name product, COPAXONE®, and a commercially available comparator, Copolymer-1, to develop a set of characterization methods for comparison and characterization of glatiramoids. These orthogonal approaches include asymmetric field flow fractionation coupled with multi-angle light scattering (AFFF-MALS), NMR and LC-MS. AFFF-MALS was used to calculate the average molecular weight, Mw, polydispersity, and provided molecular weight distribution of the polymers. NMR was used to evaluate the amino acid composition and LC-MS was used to separate and identify the peptide fragments generated from enzymatic degradation. Principal component analysis (PCA) was applied to LC-MS results to identify differences between lots of COPAXONE® and comparator lots. These methods, combined, constitute an analytical approach to characterize and compare glatiramoids. These methods have been successfully used in the characterization and evaluation of different generic glatiramer acetate applications, and led to the approval of the first generic glatiramer acetate product in 2015.

      Analytical Method Development for the Characterization of Conjugated Estrogens

      Conjugated estrogens are a mixture of conjugated steroids made from pregnant mares’ urine. It is used primarily for estrogen replacement therapy to treat menopausal symptoms and to prevent post-menopausal osteoporosis. The complexity of the chemical composition has been a barrier to the introduction of generics. For this internal project, the FDA labs first developed a robust LC-MS method to characterize and quantify the steroidal components of the conjugated estrogen from the commercial product, PREMARIN®, then the method was used to profile 23 lots of the brand-name product and identified 60 steroidal conjugates which consistently present at average levels above 0.1%. The results of this collaboration have been published and became the foundation of Agency’s PSG documents on conjugated estrogens. It has also been used as an analytical tool to evaluate the API sameness of potential generic conjugated estrogens.

      Characterization of Impurities in Peptides

      Comprehensive characterization of a peptide API is important in ensuring the API sameness for generic peptide drug development. The presence of impurities may lead to altered efficacy and/or safety, including increased immunogenicity risk. The collaborations were aimed to develop a sensitive and effective approach to profile impurities in peptide drugs. In an initial study, a data-dependent LC-MS/MS approach was developed to screen low level peptide impurities. This methodology was then applied to the impurity profiling of calcitonin salmon nasal spray, a polypeptide drug for the treatment of osteoporosis. Five marketed calcitonin salmon products were evaluated, and over 120 peptide impurities were identified. Each impurity and its monoisotopic mass and charge states were confirmed by extracted ion chromatography and manual examination of the mass spectra. Differences were observed among different products (Fig. 1, peptide impurities of >0.1% were selected to display differences in samples).

      Fig. 1: Differences in Peptide Impurities in Calcitonin Salmon Nasal Spray Products

      This approach allows for screening of those impurities that can be separated from the API peak and observed in total ion chromatography. It also allows for screening of impurities that co-eluted with the API peaks, and those that can be separated from the API peak but cannot be observed as individual peak in the total ion chromatography. This data-dependent LC-MS/MS scan greatly facilitates rapid screening of impurities in peptide drugs and provides an efficient approach for peptide drug quality control and generic drug development. Combination of LC-MS and LC-MS/MS methods provides a powerful tool in analyzing complex peptide mixtures, including mixtures purified from natural sources.

      Characterization of Host-cell Protein Impurities in Peptide Products of rDNA Origin

      The goal of this ongoing collaboration with OPQ is to develop an MS-based characterization method to identify and characterize host-cell protein (HCP) impurities in peptide drug products of rDNA origin. Literature shows that even highly purified peptide products prepared from recombinant DNA technology contain some HCPs as impurities and different host cell systems used in the manufacturing process would generate different HCPs. The potential immunogenicity risk of the HCPs for brand-name products can be evaluated in clinical studies, but clinical evaluation of immunogenicity risk is usually not part of the ANDA pathway for generic drugs. The Agency does not believe that current technology can provide sufficient information to address potential immunogenicity risk for products produced using recombinant technology without also considering clinical data. FDA is also working to develop new technologies to address this problem. MS can provide very sensitive detection and characterizations of peptides and proteins. Characterization of HCPs with MS will help us understand the HCP impurity level, composition, and impurity control of HCPs in the corresponding products. This will open the possibility of accepting ANDAs for peptide drugs produced by recombinant technology in the future.

      Assessment of Innate Immune Response Modulating Impurities in Peptide Drugs

      Immune response to peptide drugs can compromise the safety and efficacy of the products. Peptide-related impurities in synthetic peptides, HCPs and other impurities in recombinant peptides might be present in peptide drugs which can activate the innate immune system and enhance product immunogenicity. The Office of Biotechnology Products lab recently described a new approach to screen products for the presence of broad spectrum known or unknown innate immune response modulating impurities by using multiple myeloid cell lines. In this collaboration, the lab will test calcitonin salmon nasal sprays manufactured by different companies for their ability to activate innate immune response using the cell based assays. These results will be used to look for a correlation between the impurity profile of the product and the risk of immunogenicity. The benefit of this research to generic drug development is that when immunogenicity risks are identified in product development or review there can be an alternative to clinical studies to address the immunogenicity risk.

      Solid State Characterization of Polymeric Drugs

      Polymeric drugs such as sevelamer carbonate, patiromer, and colesevelam hydrochloride have been used in the treatment of various diseases. The manufacturing processes of polymeric drugs are complex and involve polymerization of different components. To facilitate the development of generic versions of these drugs, OGD and OPQ worked to characterize these complex polymeric drugs and develop criteria for active ingredient sameness evaluations. Solid state carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy (13C NMR) was used as a powerful tool in studying the composition of the polymeric drugs. Fourier transform infrared spectroscopy, thermogravimetric analysis and differential scanning calorimetrywere used to further analyze the physicochemical properties of these drugs. This project led to a better understanding of the critical quality attributes of the polymeric APIs and revision of several PSGs for polymeric drugs. It also allowed for the approval of the first generic sevelamer carbonate product in 2017.

      Key Outcomes

      The efforts of Agency research and external collaboration collectively contributed to the understanding of generic drug development for drug products with complex drug substances. During the first five years of GDUFA, the Agency published 12 PSGs for those drug products as part of the effort to establish clear, efficient and consistent regulatory standards for generic products containing complex APIs. These PSGs contributed directly to the development and approval of multiple generic drugs containing complex APIs, including three first generic approvals: glatiramer acetate for injection, sevelamer carbonate tablet, and sevelamer carbonate powder for suspension.

      The Agency also published a draft general guidance on ANDA submission of certain highly purified synthetic peptide drug products referencing products of rDNA origin. This guidance provides recommendations for generic competition in a class of reference products where it was previously not generally recommended to use the ANDA submission process.

      GDUFA regulatory research projects provided a better understanding on the nature and the complexities of the drug products with complex APIs. Results and insights gained from the research help the development of the PSGs, which directly support the review and approval of the generic versions of these complex products. Research in this area also led to the development of novel analytical technologies and characterization methods and further advanced the science through publications and presentations.

      الاتجاهات المستقبلية

      Significant progress has been made in our understanding and development of complex API and peptide products. However, further regulatory research efforts are needed. Research in botanical drugs, which are inherently complex, are in the early stages, and newer brand-name complex API products, such as oligonucleotide drug products, are being approved more frequently. Future research is needed for the development of characterization methods and API sameness standards on natural-sourced complex drug substances development of sensitive MS-based method to support bioequivalence demonstration in place of traditional clinical endpoint approach on drugs with complex API mixtures continued development of analytical methods for polymeric drugs development of analytical methods to characterize complex excipients and their interactions with drug substances and evaluations on host-cell protein impurities for peptide drug products of rDNA origin and non-clinical immunogenicity assays for generic drug products. These unmet regulatory needs will be a focus in GDUFA II that was reauthorized in 2017 for additional 5 years from 2017-2022. Scientific advances in these areas will help the development of the generic complex drugs which would otherwise be impossible. These future regulatory research priorities will contribute significantly to the ability of the American public to access generic version of these complex products.


      خيارات الوصول

      احصل على حق الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

      جميع الأسعار أسعار صافي.
      سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
      سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

      احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

      جميع الأسعار أسعار صافي.


      مناقشة

      The term cellulite is often used to describe a complex architectural disorder of the skin with multifactorial etiologies. 3 In general, the formation of cellulite is a natural process and not a disease, reflected by an incidence of about 85% in adult females. However, the appearance of cellulite can negatively affect the quality of life in women and some seriously suffer from their dimpling orange peel skin.

      The pathophysiology of cellulite is not yet fully understood, but it is generally accepted that, beside an altered connective tissue structure and a disturbed dermal extracellular matrix, overweight also has a negative effect on cellulite-prone skin areas such as thighs and buttocks. Mirrashed وآخرون. 4 demonstrated a correlation between overweight and cellulite pathophysiology in a pilot study with magnetic resonance imaging technique. Even though cellulite formation is exacerbated in combination with being overweight, it is predominantly dependent on the perpendicular orientation and status of dermal septae with regard to the skin surface. These dermal septae are much thinner and more radially oriented in cellulite-affected females compared to unaffected men and women. 20

      Today, a wide variety of cellulite treatment options exist, 21 ranging from topically applied products and massages to laser and intense pulsed light treatment among others. 1 Recently, an oral supplementation with polyphenol-rich chokeberry juice taken over a period of 90 days improved cellulite with a marked reduction in the subcutaneous tissue thickness and edema. 22 Most therapeutic approaches focus on the induction of lipolysis. However, the efficacy of such cellulite treatments seems to be less than completely satisfying, as reported by Wanner and Avram. 23

      In contrast to these various forms of treatment, an oral therapy with BCP is based on the premise that specific collagen peptides can improve and increase dermal firmness and skin elasticity from the inside.

      It is known that the improvements of dermal strength and skin elasticity are two important therapeutic aims in cellulite treatment. 21 Incidentally, Ortonne وآخرون. 24 observed that, regardless of age, the presence of cellulite corresponds to a thinning of the dermal layer, a greater length of the dermis–hypodermis interface, and a decrease of dermal density and biomechanical parameters of skin elasticity and extensibility that are negatively affected by the degree of involvement of cellulite. The authors argue that women with cellulite exhibit skin characteristics typical of older ages.

      In addition, Dobke وآخرون. 25 observed that women without cellulite had a better skin quality (firmer, with less compliance, laxity, and capacity of deformation) in the upper posterior part of the thigh. In contrast, women with cellulite showed greater laxity and weakness of the dermis and connective tissue, which extended into the superficial fascia.

      The efficacy of the BCP used in this study (VERISOL) on skin health and dermal connective tissue metabolism was recently demonstrated in two monocentric, double-blinded, randomized, placebo-control clinical trials on healthy women. Proksch وآخرون. demonstrated that skin elasticity increased statistically significantly by up to 30% (average 7%) after 8 weeks of oral BCP ingestion in comparison to placebo treatment. 11 In addition, in a follow-up study, an elastic improvement of the skin resulting from an increased biosynthesis of collagen and elastin in the dermal connective tissue was shown. 18 Hundred and fourteen women aged 45–65 years received 2.5 g BCP or placebo once daily. After 8 weeks of intake, a statistically significant higher content of new generated procollagen type I (65%) and tropoelastin (18%) in interstitial skin fluid compared to the placebo treatment was observed.

      In the present study, it could be demonstrated that a daily dosage of 2.5 g BCP has a positive impact on women affected by moderate cellulite. Beside a significant improvement in the cellulite score, results also revealed a significant decrease in the waviness of the thigh skin as well as dermis density strengthening after BCP treatment.

      With regard to the mode of action, it could be speculated that the efficacy of BCP on cellulite treatment is based on its positive impact on dermal connective tissue synthesis. This assumption was confirmed by the results of the dermal density measurements. After 6 months of oral BCP intake, a statistically significant higher dermal density (ص < 0.01) could be detected compared to placebo.

      One of the reasons for the dimpling effect in skin seems to be an abnormal pattern of distribution of elastic and collagen fibers in dermal septae. 26

      In cellulite-prone skin, both fiber types are unevenly located and partly clumped and, contrarily, in other parts of the dermal septae, rare and thinly distributed. The irregular strength of the connective tissue septae is considered as the most important distinguishing characteristic between cellulite-prone skin and unaffected skin. 3 It is known that fibrillin, as the main component of elastic fibers, is of particular importance for the integrity of these fiber bundles. 27 In a previous study, it could be demonstrated that, beside type I collagen and elastin, the fibrillin syntheses were also affected by the oral administration of BCP (VERISOL). 18 This increased synthesis of the fiber matrix molecules became clinically apparent in a statistically significant reduction of eye wrinkle deepness of 20% compared to the placebo group.

      Based on these findings, it could be speculated that the improvement in skin waviness in cellulite-prone skin observed here might be caused by the same effect. In comparison to the control group, a statistically significantly reduced skin waviness (−11%) was detected on thighs in normal weight volunteers after BCP administration.

      The efficacy of a BCP treatment could also be confirmed in overweight women (BMI >25), although the impact in this group was less pronounced in comparison to the results in women of normal weight. This observation was reflected by almost all the results obtained from the different investigations.

      It could be speculated that, especially in the group of overweight women, the duration of the treatment might be too short to see the maximum effect, as the data revealed an improvement trend but failed to reach statistical significance. It has to be stated that, at baseline, the degree of cellulite in the overweight women was statistically significantly (ص < 0.01) more pronounced than with women of normal weight, so that an extended therapy might be useful.

      Moreover, as the therapeutic effect of a BCP treatment seems to predominantly influence the dermal matrix synthesis and, thus, strengthen dermal connective tissue, the observed effect might be more distinct when the cellulite is specifically caused by connective tissue alterations. This may support the hypothesis that BCP treatment particularly influences the positive impact on fiber septae regeneration. The evaluation of the ultrasound images documents a visually detectable change in tissue structure. It was observed that the network of collagen/elastic fibers in the dermis and subcutis becomes denser.

      It has been shown that noninvasive measures such as skin profile and those obtained from ultrasound images exhibit a positive correlation among them and the subjective perception of cellulite. 28 Dermal thickness may be reduced when it is more compact, and the dermal/hypodermal interface may be shortened when the invagination of adipose tissue toward the deep dermis is reduced as in the slight degree of cellulite. 29,30 Ultrasound images captured before treatment clearly represented the irregular broken line between dermis and hypodermis, and hypoechoic structures can be interpreted as fat bulging from subcutaneous tissue into the upper-layer dermal tissue. After treatment with BCP, a significant reduction in dermal thickness, elevated echogenicity indicating increased and organized collagen tissue, and reduction of hypoechoic areas were demonstrated.

      The results obtained in this study demonstrated that an oral supplementation with specific BCP over a period of 6 months led to a clear improvement of the skin appearance in women suffering from moderate cellulite. In addition, the data showed the marked potential of BCP to improve the skin morphology of cellulite-affected areas, providing new evidence of BCP's beneficial effects and postulating a new therapy strategy for cellulite treatment.


      شاهد الفيديو: اختبار اقل فرق معنوي لمقارنة معنوية الفروق بين المتوسطات (يوليو 2022).


تعليقات:

  1. Yera

    في رأيي ، إنه مخطئ. دعونا نحاول مناقشة هذا. اكتب لي في رئيس الوزراء ، يتحدث إليك.

  2. Daijora

    العار والخزي!

  3. Bernard

    موقع جيد ، أحببت التصميم بشكل خاص

  4. Berton

    من الجيد دائمًا قراءة الأشخاص الأذكياء.

  5. Erwin

    برأيي أنك أخطأت. دعونا نناقشها.

  6. Willard

    يمكنني أن أوصي بالذهاب إلى الموقع ، حيث يوجد الكثير من المعلومات حول الموضوع الذي يثير اهتمامك.

  7. Aubert

    يا لها من عبارة ممتازة

  8. Samukasa

    انت لست على حق. أنا متأكد. دعنا نناقش. اكتب لي في رئيس الوزراء ، سوف نتحدث.



اكتب رسالة