معلومة

هل يمكنني تصوير Coomassie و GFP في مواد هلامية في نفس الوقت باستخدام ماسح ضوئي مضان؟

هل يمكنني تصوير Coomassie و GFP في مواد هلامية في نفس الوقت باستخدام ماسح ضوئي مضان؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أنا أعمل مع بروتين موسوم GFP وأستخدم بشكل روتيني مصور مضان (GE Typhoon) وماسحة ضوئية قياسية لالتقاط صور الفلورسنت والامتصاص ، على التوالي ، من المواد الهلامية SDS-PAGE الخاصة بي. يدعم Typhoon قنوات متعددة ، فهل هناك طريقة ما يمكنني من خلالها البحث عن الاثنين على نفس الجهاز (GFP + بروتين إجمالي)؟ أفترض أنني لا أستطيع الامتصاص على ماسح ضوئي مضان ...

يمكنني تسجيل الصورتين يدويًا ، لكن سيكون الأمر شاقًا نظرًا لأنهما بدرجات دقة مختلفة ، ودورات مختلفة قليلاً ، ويمكن أن يمتد الجل بشكل طفيف عند وضعه على الأسطوانات.


يتوهج اللون الأزرق Coomassie في الأشعة تحت الحمراء عند ارتباطه بالبروتين ، لذلك إذا كان لدى القارئ مجموعة المرشحات المناسبة ، فيجب أن يكون ذلك ممكنًا.


الفحص السريع للطي البروتين باستخدام البروتين الفلوري الأخضر

يعتمد تكوين الكروموفور للبروتين الفلوري الأخضر (GFP) على الطي الصحيح للبروتين. قمنا ببناء ناقل "مراسل قابل للطي" ، حيث يتم التعبير عن بروتين الاختبار على أنه اندماج طرفي N مع GFP. باستخدام لوحة اختبار مكونة من 20 بروتينًا ، أظهرنا أن تألق الإشريكية القولونية ترتبط الخلايا التي تعبر عن اندماج GFP بالطي الإنتاجي لمجالات البروتين الأولية التي يتم التعبير عنها بمفردها. استخدمنا هذا المؤشر الفلوري لطي البروتين لتطوير البروتينات التي عادة ما تكون عرضة للتجمع أثناء التعبير في بكتريا قولونية إلى بروتينات وثيقة الصلة تطوي بقوة وقابلة للذوبان بشكل كامل وعملية. لا يتطلب هذا النهج لتحسين طي البروتين فحوصات وظيفية للبروتين محل الاهتمام ويوفر طريقًا بسيطًا لتحسين طي البروتين والتعبير عن طريق التطور الموجه.


خيارات الوصول

احصل على حق الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


الصور

1. قم بإعداد 150 & mul مؤتلف GFP بتركيزات مختلفة (0.00074 نانومتر - 6.21 ميكرومتر) في محلول الفحص والمعايرة إلى 25 درجة مئوية. (المخزن المؤقت للمقايسة: 10 مم Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0) ، 10 مم EDTA ، 0.02٪ أزيد الصوديوم.)

2. اقرأ عند الإثارة بأطوال موجية 485 نانومتر وانبعاث 535 نانومتر.

- 96 لوحة ميكروبلسترين جيدة ، سوداء

3 ميكروغرام من ab84191 مخفض على SDS-PAGE ، ملطخة بـ Coomassie Blue.


إزالة الأنسجة والحفاظ على GFP في القلب

يرتبط التطور السريع واستخدام تقنيات إزالة الأنسجة بالتطور السريع لأساليب التصوير ، مثل الفحص المجهري متحد البؤر والفحص المجهري للورقة الضوئية. يمكن استخدام هذه الطرق معًا لإعادة بناء تشريح الأنسجة ثلاثي الأبعاد (Costantini et & # x000a0al. ، 2019).

أحد الكائنات الحية النموذجية الرئيسية في البحث البيولوجي هو نموذج الفأر ، بمجموعة واسعة من التعديلات الجينية المحتملة بما في ذلك إدخال البروتينات ذات العلامات الفلورية (على سبيل المثال ، GFP) كجينات مراسلة. استخدمت أول طرق تطهير الأنسجة المطورة مركبات كارهة للماء ، والتي تعمل على تجفيف الأنسجة والجفاف وإخماد البروتينات الفلورية المُدخلة (أي GFP). لتجنب هذه الظاهرة ، تم تطوير العديد من حلول المقاصة المائية (القائمة على الماء). ومع ذلك ، فإن الطرق القائمة على الماء كان لها أداء أقل في تطهير الأنسجة (Silvestri et & # x000a0al. ، 2016) ، مع الحفاظ على التألق. يوضح الشكلان 2 C و 2 D الحفاظ على مضان GFP في القلب الجنيني للمراحل المختلفة (ED10.5 و ED14.5) بواسطة طريقة تطهير الأنسجة CUBIC. إلى جانب استخدام محلول المقاصة المحبة للماء ، هناك طريقة أخرى للحفاظ على التألق وهي طريقة تحويل الأنسجة التي تتضمن تضمين الأنسجة في هلام الأكريلاميد & # x02014 CLARITY (Chung et & # x000a0al. ، 2013).

أمثلة على مناعة والحفاظ على مضان GFP مع تطهير الأنسجة على قلب الفأر النامي

(A و B) الكيمياء المناعية المدمجة مع BABB على جنين الماوس ED 9.5 ، والأجسام المضادة للأكتين العضلية الملساء (SMA) في وضع العلامات الحمراء على عضلة القلب ، CD31 (PECAM-1) باللون الأخضر لتلطيخ الشغاف (B) ، وتلطيخ DAPI النووي (ليس كثيرًا مميزة عند هذا التكبير المنخفض) باللون الأزرق.

(C و D) الحفاظ على مضان GFP الطبيعي مع تطهير الأنسجة CUBIC على ED 10.5 (C) و ED 14.5 (D) في قلوب جنين الفأر Connexin 40 - GFP (Cx40-GFP) مع تألق ذاتي متراكب باللون الأحمر. تكون الترابيق البطيني والأذينين موجبين لـ Cx40 في هذه المراحل. يوجد دم ذاتي الفلورسنت في البطينين (C). تم التقاط جميع الصور بالمجهر (كنفوكل). يمثل شريط المقياس 100 & # x000a0 & # x003bcm في جميع الأشكال.

أجرى Xu وزملاؤه (Xu et & # x000a0al.، 2019b) تحليلًا مفصلاً للحفاظ على الفلورة بواسطة طرق المقاصة المختلفة على أنسجة الأمعاء. وأكدوا أن معظم طرق المقاصة المائية كان أداؤها أفضل في الحفاظ على الفلورة من تلك المعتمدة على المذيبات العضوية. عند قياس نسبة الإشارة إلى الخلفية بعد إزالة الأنسجة ، وجدوا أن أفضل طريقة للحفاظ على التألق هي الفاكهة ، تليها ScaleS و SeeDB. ومع ذلك ، حافظ كل من CUBIC و PACT على مستويات مماثلة من التألق مثل 3DISCO و uDISCO ، وهما من عوامل التطهير العضوية الكارهة للماء. لم يشملوا CLARITY واختلافاته في اختبارهم. على الرغم من أن دراستهم تضمنت أنسجة القلب ، إلا أن الجزء المتعلق بالحفاظ على الفلورة تم إجراؤه على الأمعاء ، والتي قد تتفاعل بشكل مختلف عن أنسجة القلب الكثيفة وذات الأوعية الدموية. لذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من التحليل لـ 3DISCO و uDISCO و FRUIT على أنسجة القلب. تم تلخيص نظرة عامة في الشكل & # x000a01.

فقط عدد قليل من الدراسات قامت بتحليل مباشر لتوافق تطهير الأنسجة والحفاظ على التألق في أنسجة القلب البالغة أو الجنينية. في دراستنا السابقة (Kolesova et & # x000a0al. ، 2016) استخدمنا أساليب المقاصة CLARITY و SCALE و CUBIC و DBE وقارننا قدرتها على الحفاظ على مضان GFP في القلوب الجنينية (موضحة في الأشكال 2 C و 2D و & # x200B و 3 B 3 B مع تطهير الأنسجة CUBIC على Cx40: GFP trabeculae والأوعية الدموية التاجية في قلوب الجنين). وجدنا أن CUBIC نظف الأنسجة إلى مستوى أعمق مقارنة بالمقياس وبالتالي كان أكثر ملاءمة لتحليل القلوب السليمة. ومع ذلك ، على الرغم من أن SCALE حافظ أيضًا على إشارة GFP ، إلا أنه قام فقط بمسح الطبقات السطحية للقلب ، والتي قد تكون كافية لدراسات الأوعية الدموية الكبيرة في الأوعية الدموية التاجية (Kolesova et & # x000a0al. ، 2016). كان الفرق بين SCALE و CUBIC أكثر وضوحًا في قلوب ما بعد الولادة ، حيث قام CUBIC بتطهير القلوب بشكل فعال ، في حين أن المقياس لم يكن كذلك (Shaikh Qureshi et & # x000a0al.، 2016). اختبرت دراسة أخرى قدرة CUBIC على الحفاظ على إشارات الفلورسنت المختلفة في أنسجة القلب (Nehrhoff et & # x000a0al. ، 2016). وجدوا أن المقاصة CUBIC يمكنها أيضًا الحفاظ على البروتينات الفلورية الأخرى مثل TdTomato و GFP في أقسام قلب بسمك 750 & # x003bcm.

تصور الأوعية الدموية التاجية في القلوب النامية

(أ) تم حقن الأوعية الدموية مع DiI في جنين السمان ED9.

(ب) تم تصور الشرايين التاجية على سطح قلب جنين فأر ED18.5 Cx40-GFP تم تطهيره باستخدام CUBIC. تم تصويره على مجهر متحد البؤر.

(C) تحليل القلب المحقون DiI مع الأوعية التاجية pseudocolored للإشارة إلى العمق داخل جدار البطين ، جنين السمان ED13.

(د) قلب فأر اليافع مع الأوعية التاجية المحقونة بالميكروفيل والشرايين التاجية الرئيسية المشار إليها باللون: الشريان التاجي الأيمن (البرتقالي) وفرعه ، الشريان الحاجز (الأحمر) ، والشريان التاجي الأيسر (الأصفر). تم تصويره على ماسح التصوير المقطعي المحوسب الصغير.

ثبت أيضًا أن CLARITY تحافظ على العديد من البروتينات الفلورية مثل GFP و mCherry و mOrange و Cerulean في أنسجة القلب (Sereti et & # x000a0al. ، 2018). أيضًا ، تم استخدام بروتوكولات CLARITY المعدلة لتحليل أنسجة القلب. تم استخدام SUT (تحديث مخطط لشفافية الأنسجة ، مزيج من CUBIC و CLARITY) لتحليل التئام التليف في احتشاء عضلة القلب (Wang et & # x000a0al. ، 2018). تم استخدام SCM (طريقة CLARITY المبسطة) لتحليل أنسجة القلب (Sung et & # x000a0al. ، 2016) ومع ذلك ، تم الحصول على نتائج أفضل عندما تم غسل الدم من القلب قبل التثبيت حيث أدى إزالة لون الهيم باستخدام العلاج بالكحول الأميني إلى تقليل مضان YFP في عينات القلب (Sung et & # x000a0al. ، 2016).


مرفق تسلسل الجيل التالي (NGSF) هو مرفق علم الجينوم عالي الإنتاجية يقع في جامعة ساسكاتشوان. وهي مدعومة من وكالة ساسكاتشوان للسرطان وكلية الطب بجامعة ساسكاتشوان. الهدف الأساسي من NGSF هو زيادة البحوث الأساسية والسريرية من خلال توفير الوصول إلى تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية والخبرة.

بالإضافة إلى خدمات إعداد المكتبات والتسلسل ، تتوفر أيضًا خدمات تحليل البيانات والمعلوماتية الحيوية ، إما معًا أو بشكل مستقل.

قم بزيارة صفحة NGSF الرئيسية لمزيد من المعلومات ، بما في ذلك قائمة المعدات المشتركة (Qubit و Tapestation و qPCR و iSeq و NextSeq والمزيد). اتصل بنا لمناقشة أهداف مشروعك والحصول على عرض أسعار للخدمة.

     


Pinheiro، A. V.، Han، D.، Shih، W. M. & amp Yan، H. التحديات والفرص لتقنية النانو الهيكلية للحمض النووي. نات. النانو. 6, 763–772 (2011).

وانج ، ز.ج ، سونج ، سي & أمبير دينج ، ب. هياكل نانوية وظيفية للحمض النووي للتطبيقات الضوئية والطبية الحيوية. صغير 9, 2210–2222 (2013).

ريماوت وآخرون. يستمر التبادل بين المانحين في مجموعة بيلوس بمساعدة المرافقة من خلال آلية إزاحة حبلا بيتا منسقة. مول. زنزانة 22, 831–842 (2006).

بارانوفا ، إي وآخرون. هيكل SbsB وإعادة بناء الشبكة يكشفان عن تجميع طبقة S. طبيعة سجية 487, 119–122 (2012).

King، N.P & amp Lai، Y. T. مناهج عملية لتصميم مجموعات بروتينية جديدة. بالعملة. رأي. هيكل. بيول. 23, 632–638 (2013).

Howorka، S. هندسة تجميعات البروتين الطبيعي بشكل رشيد في التكنولوجيا الحيوية النانوية. بالعملة. رأي. التكنولوجيا الحيوية. 22, 485–491 (2011).

Main، E.R، Phillips، J.J & amp Millership، C. كرر هندسة البروتين: إنشاء بنى نانوية وظيفية / مواد حيوية من وحدات بناء معيارية. بيوتشيم. شركة نفط الجنوب. عبر. 41, 1152–1158 (2013).

لاي ، واي.تي وآخرون. هيكل قفص البروتين المصمم الذي يتجمع ذاتيًا في مكعب مسامي للغاية. نات. تشيم. 6, 1065–1071 (2014).

سنكلير ، جي سي ، ديفيز ، كيه إم ، فينين-بريان ، سي & أمبير نوبل ، إم إي جيل من مشابك البروتين عن طريق دمج البروتينات مع التناظر الدوراني المطابق. نات. النانو. 6, 558–562 (2011).

King، N. P. et al. تصميم دقيق للمواد النانوية البروتينية متعددة المكونات المشتركة. طبيعة سجية 510, 103–108 (2014).

King، N. P. et al. التصميم الحسابي للمواد النانوية البروتينية ذاتية التجميع بدقة المستوى الذري. علم 336, 1171–1174 (2012).

Der، B. S. & amp Kuhlman، B. استراتيجيات للتحكم في وضع الربط لتفاعلات البروتين المصممة من قبل de novo. بالعملة. رأي. هيكل. بيول. 23, 639–646 (2013).

Lai، Y. T.، Cascio، D. & amp Yeates، T.O. هيكل قفص 16 نانومتر مصمم باستخدام أوليغومرات البروتين. علم 336, 1129 (2012).

فويت ، إيه آر وآخرون. التصميم الحسابي لبروتين دافع β متماثل ذاتي التجميع. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 111, 15102–15107 (2014).

ماتسوناجا ، آر ، ياناكا ، إس ، ناجاتويشي ، إس. وأمبير تسوموتو ، كيه. هايبرثين نانوكينز مكونة من أغلال بروتينية ذاتية البلمرة. نات. كومون. 4, 2211 (2013).

Oohora ، K. ، Onoda ، A. & amp Hayashi ، T. أنظمة التجميع الجزيئية الفائقة التي تشكلت من تفاعلات الهيم الهيم الجيب في البروتينات الدموية. تشيم. كومون. 48, 11714–11726 (2012).

كارلسون ، جي سي وآخرون. التجميع الذاتي الخاضع للرقابة كيميائيًا لنانورات البروتين. جيه. تشيم. شركة نفط الجنوب. 128, 7630–7638 (2006).

برودين ، جيه دي وآخرون. تجميع معدني قابل للضبط كيميائيًا لمصفوفات بروتين بلورية أحادية وثنائية وثلاثية الأبعاد. نات. تشيم. 4, 375–382 (2012).

Lai، Y. T.، King، N.P & amp Yeates، T.O. مبادئ تصميم مجموعات البروتين المطلوبة. اتجاهات خلية بيول. 22, 653–661 (2012).

Modica، J. A.، Skarpathiotis، S. & amp Mrksich، M. تجميع معياري لبنات بناء البروتين لإنشاء جزيئات ضخمة محددة بدقة. كيمبيوتشيم 13, 2331–2334 (2012).

هو ، سي وآخرون. بناء أسلاك نانوية للبروتين من خلال القرع [8] تفاعلات عالية النوعية تعتمد على البول بين المضيف والضيف: نهج لتجميع البروتينات الوظيفية. انجيو. تشيم. كثافة العمليات إد. 52, 5590–5593 (2013).

Fierer، J. O.، Veggiani، G. & amp Howarth، M. SpyLigase peptide-peptide liation بلمرة الأجسام الداعمة لتعزيز التقاط الخلايا السرطانية المغناطيسية. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 111, 1176–1181 (2014).

Fegan ، A. ، White ، B. ، Carlson ، J.C & amp Wagner ، C.R. تجميع البروتين المتحكم فيه كيميائيًا: التقنيات والتطبيقات. تشيم. القس. 110, 3315–3336 (2010).

Hoersch، D.، Roh، S. H.، Chiu، W. & amp Kortemme، T. نات. النانو. 8, 928–932 (2013).

Pédelacq، J.D، Cabantous، S.، Tran، T.، Terwilliger، T.C & amp Waldo، G. S. هندسة وتوصيف بروتين فلوري أخضر فائق المجلد. نات. التكنولوجيا الحيوية. 24, 79–88 (2006).

Cabantous ، S. ، Terwilliger ، T. C. & amp Waldo ، G. S. نات. التكنولوجيا الحيوية. 23, 102–107 (2005).

كينت ، ك. ب ، تشايلدز ، دبليو آند بوكسر ، إس جي تفكيك البروتين الفلوري الأخضر. جيه. تشيم. شركة نفط الجنوب. 130, 9664–9665 (2008).

عينة ، V. ، نيومان ، R. H. & amp Zhang ، J. هيكل ووظيفة البروتينات الفلورية. تشيم. شركة نفط الجنوب. القس. 38, 2852–2864 (2009).

إبراهيم ، أ. وأمبير كامبل ، ر. إ. تصميمات وتطبيقات أجهزة الاستشعار الحيوية القائمة على البروتين الفلوري. بالعملة. رأي. تشيم. بيول. 14, 30–36 (2010).

لورانس ، إم إس ، فيليبس ، ك.ج ، أمبير ليو ، دي آر ، يمكن للبروتينات فائقة الشحن أن تمنح مرونة غير عادية. جيه. تشيم. شركة نفط الجنوب. 129, 10110–10112 (2007).

الصوم ، سي وآخرون. تعددية التكافؤ كمنظمة كيميائية ومبدأ العمل. انجيو. تشيم. كثافة العمليات إد. 51, 10472–10498 (2012).

Mammen ، M. ، Choi ، S.-K. & amp Whitesides ، G.M. التفاعلات المتعددة التكافؤ في النظم البيولوجية: الآثار المترتبة على تصميم واستخدام الروابط والمثبطات متعددة التكافؤ. انجيو. تشيم. كثافة العمليات إد. 37, 2754–2794 (1998).

Kiessling ، L.L ، Gestwicki ، J.E & amp Strong ، L. E. الروابط الاصطناعية متعددة التكافؤ كمجسات لتوصيل الإشارة. انجيو. تشيم. كثافة العمليات إد. 45, 2348–2368 (2006).

Levine، P. M.، Carberry، T. P.، Holubb، J.M & amp Kirshenbaum، K. صياغة معماريات دقيقة متعددة التكافؤ. ميد. تشيم. كومون. 4, 493–509 (2013).

إنجلوند ، إي إيه وآخرون. عرض متعدد التكافؤ قابل للبرمجة لرباطات المستقبلات باستخدام السقالات النانوية للحمض النووي الببتيد. نات. كومون. 3, 614 (2012).

Jung ، Y. ، Lee ، J.M ، Jung ، H. & amp Chung ، B.H. تثبيت الجسم المضاد الموجه ذاتيًا والذاتي التوجه عن طريق بروتين G-DNA المتقارن. شرجي. تشيم. 79, 6534–6541 (2007).

Munoz ، E. M. ، Correa ، J. ، Riguera ، R. & amp Fernandez-Megia ، E. جيه. تشيم. شركة نفط الجنوب. 135, 5966–5969 (2013).

Li، M.H، Choi، S. K.، Leroueil، P.R & amp Baker، J.R.J. تقييم الرغبة الملزمة لمجموعات من الجسيمات النانوية متعددة التكافؤ متعددة التكافؤ. ACS نانو 8, 5600–5609 (2014).

Hartman، N.C & amp Groves، J. T. مجموعات الإشارات في غشاء الخلية. بالعملة. رأي. زنزانة. بيول. 23, 370–376 (2011).

كونواي ، أ. وآخرون. تتحكم الروابط متعددة التكافؤ في سلوك الخلايا الجذعية في المختبر وفي الجسم الحي. نات. النانو. 8, 831–838 (2013).

شو وآخرون. التحكم المكاني في وظيفة مستقبلات الغشاء باستخدام ligand nanocalipers. نات. أساليب 11, 841–846 (2014).

تشو ، إم إتش وآخرون. مفتاح مغناطيسي للتحكم في إشارات موت الخلية في الأنظمة المختبرية والحيوية. نات. ماتر. 11, 1038–1043 (2012).

سبانجلر ، ج.ب.وآخرون. ينظم العلاج المركب بالأجسام المضادة مستقبلات عامل نمو البشرة عن طريق تثبيط إعادة التدوير داخل الجسم. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 107, 13252–13257 (2010).

فريدمان ، إل إم وآخرون. التنظيم النازل التآزري لمستقبلات كينازات التيروزين عن طريق مجموعات من mAbs: الآثار المترتبة على العلاج المناعي للسرطان. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 102, 1915–1920 (2005).

أوليفيرا ، إس وآخرون. تقليل تنظيم EGFR من خلال منصة جديدة متعددة التكافؤ لجسم نانوي-ليبوزوم. J. التحكم في الإصدار 145, 165–175 (2010).

بهاردي ، أ. وآخرون. الجسيمات النانوية المغناطيسية كوسيط للتنشيط الخالي من الترابط لإشارات EGFR. بلوس واحد 8، e68879 (2013).

لي ، ب وآخرون. انتقالات الطور في تجميع بروتينات التأشير متعددة التكافؤ. طبيعة سجية 483, 336–340 (2012).

داستن ، إم إل آند غروفز ، جي تي. مجموعات إشارات مستقبلات في المشبك المناعي. Annu. القس بيوفيس. 41, 543–556 (2012).


مناقشة

في هذه الورقة نصف إنشاء سقالة ملزمة على أساس GFP. باستخدام عناصر الربط المشتقة من الأجسام المضادة HCDR3s وإدخالها في ما يصل إلى أربعة مواضع محددة لشكل من GFP تم تطويره لتحقيق الاستقرار وقوة الطي ، قمنا بدمج مزايا الأجسام المضادة (ارتباط محدد وعالي التقارب) مع مزايا GFP (التألق الجوهري) والاستقرار ومستويات عالية من التعبير). ومع ذلك ، على عكس بروتينات اندماج جزء الجسم المضاد GFP 22 ، فإن التألق هو جوهري لرابط الربط. كان الانتقال من الحالة المشوهة إلى الحالة المطوية مصحوبًا بإعادة اكتساب كل من نشاط الربط والتألق ، مما سمح لنا بتحديد تركيزات الأجسام الفلورية الوظيفية وكذلك تحديد أوجه التشابه (الأشكال 5 ج ، د). على الرغم من أنه من المحتمل أن تكون هذه هي الحالة المعتادة ، فمن المعروف أن طي GFP إلى هيكل العلبة يكون سريعًا نسبيًا (t / 2 = 10 min) ، كما هو الحال مع التكوين اللاحق للكروموفور المختزل. ومع ذلك ، فإن إنشاء اللون الفلوري المؤكسد يكون أبطأ بكثير (t / 2 = 76 دقيقة) 23 ، مما يشير إلى أنه إذا تم إنشاء التشكل الصحيح لحلقات الربط في نفس الوقت مع طي β-can ، فقد يكون من الممكن أن تخلق بشكل مصطنع حالة جسم فلور متوسط ​​قصير العمر حيث يوجد نشاط ملزم بدون تألق ، على الرغم من أنه من غير المحتمل أن يكون موجودًا في ظل الظروف العادية. لم يتم تحديد ما إذا كان من الممكن القضاء على نشاط الربط في وجود مضان مستمر من خلال ، على سبيل المثال ، الانقسام المحلل للبروتين في حلقات الربط.

من مكتبة صغيرة (10 7) من الأجسام الفلورية ، اخترنا روابط محددة ضد عدد من المستضدات المختلفة ذات الصلات النانوية. كانت هذه الأجسام الفلورية وظيفية في تنسيقات تجريبية مختلفة يتم فيها استخدام الأجسام المضادة بشكل تقليدي ، مع ميزة أنه لا يلزم سوى حضانة واحدة ، وأن قراءة الارتباط تكون فورية وليست معتمدة على الكواشف الثانوية. من المشجع جدًا أن تقاربات الأجسام الفلورية التي تم الحصول عليها كانت مماثلة لتلك الموجودة في مكتبات الأجسام المضادة ذات الحجم المماثل 4،24. هذا على النقيض من العديد من السقالات الأخرى التي ، ما لم تكن مبنية على طية الغلوبولين المناعي 25 ، 26 ، 27 ، تميل إلى أن لا تكون أكبر من ميكرومولار. على الرغم من عدم توضيحها رسميًا ، فإننا ننسب هذه الارتباطات العالية إلى ميزات تصميم جسم الفلور: تستخدم CDRs للجسم المضاد كعناصر ربط في أحد طرفي سقالة ثابتة ذات بصمة مماثلة (انظر الشكل 1) إلى مجال الجسم المضاد Fv.

ومع ذلك ، فإن أحد الاختلافات اللافتة للنظر بين الأجسام الفلورية والأجسام المضادة هو تنوع الروابط التي تم الحصول عليها. من بين 25 جسمًا مفلورًا مضادًا لليوبيكويتين المتسلسلة ، كانت جميعها مختلفة ، ولم يتم العثور على تنوع في مكتبات الأجسام المضادة الأكبر حجمًا 5،28،29 ، ما لم يتم تحليل العديد من الحيوانات المستنسخة في وقت مبكر من عملية الاختيار. من المحتمل أن يكون هذا التقييد في التنوع في اختيار الجسم المضاد ناتجًا عن التأثيرات الانتقائية السلبية لتأثيرات السمية والنمو. من المحتمل أن الأجسام الفلورية ، التي تفتقر إلى سمية شظايا الأجسام المضادة ، ولديها مستويات تعبير أفضل بكثير ، لا تعاني من هذه المشكلات ، مما يسمح ببقاء مجموعة أكبر من الحيوانات المستنسخة ، حتى بعد عدد من جولات الاختيار.

واجهت المحاولات السابقة لاستخدام GFP كسقالة ربط بشكل عام نتائج سيئة 9،10 ، مع مضان منخفض جدًا أو غائب بعد إدخال أي من الروابط أو الببتيدات العشوائية في مواقع محددة أو عشوائية. من المحتمل أن يرجع نجاح استراتيجيتنا إلى استخدام حلقات ربط محددة بدقة ، بدلاً من الأحماض الأمينية العشوائية ، واستخدام GFP عالي الاستقرار كسقالة (superfolder GFP ، S. Cabantous ، H. Cai ، T. يحتوي GSW ، غير المنشور ، على ستة طفرات إضافية تزيد من الاستقرار والطي ، انظر الطرق التكميلية عبر الإنترنت لمزيد من التفاصيل). بالإضافة إلى التجارب التي تم الإبلاغ عنها هنا ، أنشأنا أيضًا مكتبة باستخدام أليغنوكليوتيدات متحللة (NNK) ترميز ستة أحماض أمينية في كل موضع في نفس سقالة GFP (البيانات غير معروضة). كانت النسبة المئوية للمستعمرات الخضراء أقل في هذه المكتبة (20٪) ، وكانت هناك حاجة لجولات أكثر من الاختيار للحصول على روابط إيجابية ووجد أن تنوع الحيوانات المستنسخة المختارة أقل بكثير. ربما لا يكون هذا مفاجئًا ، نظرًا لأنه من المتوقع وجود نسبة عالية من رموز التوقف (79 ٪) في 24 كودونًا متدهورًا.

لقد أظهرنا أن الأجسام الفلورية لها خصائص إثارة / انبعاث مضان تشبه إلى حد بعيد سقالة GFP المستخدمة ، باستثناء أن بعض الأجسام الفلورية بدت وكأنها ساطعة بنسبة 50 ٪ فقط. التغييرات في التألق النسبي مع طفرات GFP شائعة (انظر المرجع 30 للمراجعة) ، ومن وجهة النظر هذه ، فإن الأجسام الفلورية هي طفرات GFP. على الرغم من أن الأجسام الفلورية الموصوفة هنا تنبعث من الفلور الأخضر ، فلا يوجد سبب لعدم إمكانية إنشاء أجسام فلورية من ألوان أخرى ، إما عن طريق إدخال طفرات معروفة في أجسام فلورية خضراء مختارة (على سبيل المثال، Y66H لإنشاء بروتين فلوري أزرق) ، أو عن طريق إنشاء مكتبات فلوروبودي مماثلة بناءً على ألوان سقالة بديلة.

لقد استخدمنا عرض الملتهمة لتحديد الأجسام الفلورية الوظيفية ، ومع ذلك ، نظرًا لأنه يتم التعبير عنها جيدًا في كل من السيتوبلازم و periplasm ، فمن المحتمل أن يكون أي تنسيق عرض (عرض جرثومي أو خميرة أو ريبوسوم أو عرض قائم على البوروميسين) مناسبًا ، بما في ذلك الاستراتيجيات الجينية ، مثل خميرة أو بكتيرية 31 نظامًا ثنائي الهجين. إن السهولة التي يمكن بها اختيار الأجسام الفلورية والتعبير عنها وتنقيتها واستخدامها ستسهل تطبيقها في تجارب علم الأحياء في الأنظمة عالية الإنتاجية. على وجه الخصوص ، يجب أن تثبت الأجسام الفلورية أنها مفيدة بشكل خاص في عدد من تنسيقات المصفوفة ، بما في ذلك الجسم المضاد أو الأنسجة أو مصفوفات التنسيق العكسي ، وتجنب الحاجة إلى وضع العلامات والخطوات الإضافية.

تعمل الأجسام الفلورية في جميع الاختبارات الأولية التي تستخدم فيها الأجسام المضادة بشكل تقليدي. بالنسبة للتألق المناعي وقياس التدفق الخلوي ، لا يمكن تمييز النتائج عن تلك التي تم الحصول عليها باستخدام الكواشف التقليدية ، ومن المحتمل أن تكون كواشف فعالة للترسيب المناعي وقياس الطيف الكتلي ، كما هو موضح سابقًا لـ scFvs 32. ومع ذلك ، فإن استخدامها في التمنيع داخل الخلايا لخلق ضربات قاضية مشروطة ، والتي تستخدم فيها الأجسام المضادة بشكل تقليدي ، من المرجح أن تكون فعالة بشكل خاص. بالإضافة إلى تجنب الحاجة إلى إنشاء مكتبات متخصصة من الأجسام المضادة تكون مستقرة وعملية في الوسط داخل الخلايا 33 ، ستوفر الأجسام الفلورية أيضًا معلومات عن توطين الهدف بحكم تألقها الداخلي ، بالإضافة إلى توفير تأكيد فوري لتعبير الجسم الفلوري المناسب. بهذا المعنى ، من المحتمل أن يقدموا بيانات تكميلية لـ RNAi 34 ، الذي لا يستطيع إعطاء أي معلومات عن التوطين ، وقد ثبت مؤخرًا أنه يؤثر على الجينات غير المستهدفة 35 ، 36 ، 37. من المحتمل أن تتعلق مزايا مماثلة باستخدامها في دراسات الحقن المجهري.

باختصار ، تعد الأجسام الفلورية بأن تكون روابط ربط فعالة للغاية ، لكل من الأبحاث القياسية وعالية الإنتاجية على مستوى الأنظمة. تجعلها الفلورة الجوهرية قابلة للتطبيق على الفور في العديد من الاختبارات القائمة على الفلورسنت المستخدمة حاليًا في التحقق من صحة الهدف وتطوير الأدوية ولديها إمكانات واضحة في التشخيص وأجهزة الاستشعار الحيوية و في الجسم الحي التصوير.


خدمات

لدينا مجموعة واسعة من أدوات الفحص المجهري بما في ذلك مجاهر widefield ومجاهر حاضنة وماسح ضوئي رقمي للشرائح وقارئ عالي المحتوى ومجهر متحد البؤر ومجهر فائق الدقة وتقنيات الألواح الضوئية.

يمكن لفريقنا تزويدك بالاستشارة أو التدريب أو التطوير أو الجلسات المساعدة.

مصدر الصورة: Cellular Imaging الأساسيين

نحن نشغل اثنين من الماسحات الضوئية وبرامج مخصصة للتصوير والتحليل الكمي للمواد الهلامية والبقع والألواح ، بما في ذلك تطبيقات مثل اللطخات الشمالية والجنوبية والغربية و In-Cell Westerns والمزيد.

يوفر فريقنا التدريب لجميع المستخدمين لأول مرة. عند الطلب ، يمكن لفريقنا مسح البقع وتحليلها.

مصدر الصورة: Cellular Imaging الأساسيين

التنميط النووي هو تحليل الكروموسومات في الخلية. يحدد النمط النووي عدد الكروموسومات وظهورها ويكتشف التشوهات الصبغية مثل الكروموسومات المفقودة أو الزائدة (اختلال الصيغة الصبغية) ، بالإضافة إلى مجموعة متنوعة من الانحرافات الصبغية (مثل الحذف والانتقالات). نحن نقدم خدمة تنميط نووي محدودة للبحث فقط - على سبيل المثال ، لاختبار خطوط الخلايا. نحن نمثل خلايا الإنسان والفأر في النمط النووي وقد ننظر في أنواع أخرى.

مصدر الصورة: Cellular Imaging الأساسيين


BiFCتكملة الأسفار ثنائية الجزيئية
BiLCتكملة التلألؤ ثنائي الجزيئي
بريتنقل طاقة الرنين تلألؤ بيولوجي
مصرف البحرين المركزيكوماسي الأزرق اللامع
CFPسماوي FP
coBiFCالتوطين المشترك لمجمعات BiFC
ECLالتلألؤ الكيميائي المعزز
FPبروتين الفلورسنت
FP ج جزء FP C- محطة
FP ن جزء FP N- المحطة
أقلقنقل طاقة الرنين الفلوري
GFPالأخضر FP
iBiSCعزل مجمعات BiFC المستقرة
mcBiFCمتعدد الألوان BiFC
التطوير التنظيمي600الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر
PCAفحص مكمل جزء البروتين
PPIتفاعل البروتين البروتين
PVDFالبولي فينيل الفلورايد
طلب تقديم العروضأحمر FP
RLucرينيلا رينيفورميس لوسيفيراز
SUSنظام انقسام يوبيكويتين
TEVالأنزيم البروتيني لفيروس حفر التبغ
UbFCتكملة مضان بوساطة يوبيكويتين
Y2Hخميرة هجين
YFPأصفر FP

1 قبل إنشاء بنيات اندماج BiFC ، استخدم موارد الويب لتحليل الهيكل ، والتوطين الخلوي الفرعي وإشارات الاستهداف للبروتينات ذات الأهمية (على سبيل المثال http://aramemnon.botanik.uni-koeln.de/ [100] http: // www .expasy.ch / [101] والروابط فيه). قد يؤدي اندماج علامات BiFC إلى الطرف الخاطئ إلى إخفاء إشارات الاستهداف والتأثير على توطين البروتين. من ناحية أخرى ، يتم تقليل مستويات التعبير لبعض البروتينات بشكل كبير عند استخدام اتجاه علامة معين. من المستحسن إنشاء تركيبات اندماج FP كاملة الطول في عمود فقري متجه مشابه لمتجهات BiFC المستخدمة ولتحليل التوطين المناسب والتعبير عن بروتينات الاندماج قبل إنشاء بنيات BiFC. إذا كان من الممكن تأكيد التعبير والتوطين المناسب عن طريق التحليلات المجهرية ، فمن المستحسن استخدام اتجاه علامة BiFC مشابه. في حالة عدم توفر معلومات حول توطين البروتين ، قم بإنشاء بنيات اندماج FP مع اتجاهات علامة FP ذات الصلة N- و C- الطرفية (مثل استعلام CFP والاستعلام- YFP) وقم بإجراء تحليلات التعريب المشترك. إذا كان كلا الاتجاهين ممكناً ، فاستخدم اندماج علامة BiFC- الطرفية (استعلام- BiFC) لأن اندماج علامة N-terminal BiFC قد ينتج عنه إشارات خلفية أعلى (Waadt و Kudla ، نتائج غير منشورة).

الضوابط المناسبة هي المفتاح لتحليلات BiFC نصف الكمية المناسبة لأن BiFC لا رجعة فيه وقد يثبت مجمعات البروتين المكونة عشوائيًا (9 ، 39). أفضل تحكم سلبي هو استخدام فرد مختلف من العائلة لأحد البروتينات التي تم فحصها. قد تكون الطفرات النقطية التي تعطل التفاعل أو الحذف بنيات المجال المتفاعل مناسبة أيضًا. من المهم أن يكون التحكم السلبي موضعيًا في نفس الحجرة الخلوية ويعرض مستوى تعبير مماثل مقارنة بالبروتين المرجعي. لا ينصح باستخدام عناصر التحكم في المتجهات الفارغة لأن التعبير عن شظايا FP وحده لا يفي بالمتطلبات المذكورة أعلاه.

2 من أجل قمع الاستجابات المناعية للنبات ، قد يفكر المرء أيضًا في التعبير المشترك عن سيودوموناس سيرينجاي النوع الثالث المستجيب AvrPto (102).

3 بالإضافة إلى تسلل النباتات البرية ، يمكن أيضًا إجراء تجارب BiFC في النباتات الطافرة ، في نباتات GVG-AvrPto (102) التي تمكن من تثبيط الاستجابة المناعية المحفزة بالديكساميتازون أو في rdr6-11 متحولة (103) ناقصة في إسكات الجينات بعد الترجمة.

4 بنثاميانا يمكن زراعة النباتات إما في الدفيئة أو في غرفة نمو ذات ظروف نهارية طويلة ، 90 & # x02013 120 & # x003bcE m & # x022122 s & # x022121 شدة الضوء و 22 & # x02013 27 & # x000b0C.

ظروف النمو المثلى ل أرابيدوبسيس النباتات هي ظروف نهارية قصيرة (8 ساعات فاتحة / 16 ساعة مظلمة) مع 90 & # x003bcE m & # x022122 s & # x022121 شدة الضوء عند 23 & # x000b0C (94 ، 95). ومع ذلك ، يتم تحقيق التعبير العابر أيضًا في ظروف النهار الطويل (16 ساعة ضوء / 8 ساعات مظلمة) مع 50 & # x02013 80 & # x003bcE m & # x022122 s & # x022121 شدة الضوء عند 27 & # x000b0C. أهم شيء لتحقيق مستويات عالية من البروتين هو استخدام الأوراق الصغيرة للنباتات في مرحلة ما قبل الانغلاق. يومين إلى ثلاثة أيام قبل التسلل أرابيدوبسيس يجب أن تتوقف النباتات عن الري ويجب أن تظل النباتات المسائية التي تسبق تسلل النباتات في ظلام دامس حتى إجراء التسلل. هذا يقلل من ضغط الحقنة اللازمة لإجراء التسلل. قد يؤدي ارتفاع ضغط المحقنة أثناء التسلل إلى تلف الأوراق. بعد التسلل أرابيدوبسيس تحتاج النباتات إلى إعادة المياه وإبقائها تحت رطوبة عالية عن طريق رش الماء وتغطيتها بغطاء بلاستيكي لمدة 24 ساعة على الأقل.

A-YFP N / B-YFP C / CFP أو RFP (عينة)

C-YFP N / B-YFP C / CFP أو RFP (تحكم سلبي)

A-YFP N / D-YFP C / CFP أو RFP (تحكم سلبي)

أطفره-YFPN / B-YFP C / CFP أو RFP (تحكم سلبي)

A-YFP N / Bطفره-YFPC / CFP أو RFP (تحكم سلبي)

أحذف-YFPN / B-YFP C / CFP أو RFP (تحكم سلبي)

A-YFP N / Bحذف-YFPC / CFP أو RFP (تحكم سلبي)

هنا ، ينتمي C و D إلى عائلة البروتين الخاصة بكل من A و B وتشير الطفرة أو الحذف إلى تعديلات محتملة في مجالات التفاعل المعنية. يجب تحديد اتجاه علامة BiFC وفقًا للملاحظة 1. لتسلل بنثاميانا، يوصى بالتسلل المشترك لسلالة مثبط الإسكات p19 (97).

6 لاختراق بنثاميانا يترك OD600 من أجروباكتريا يمكن تعديلها بين 0.05 و 2 ، حيث يكون OD أعلى600 يؤدي عادةً إلى مستويات تعبير أعلى.

لتسلل أرابيدوبسيس يترك OD600 من أجروباكتريا يمكن تعديله بين 0.4 و 0.9 للحصول على مستوى تعبير مناسب ولكن يجب ألا يتجاوز إجمالي OD600 1.2 لأن هذا يؤدي إلى تكوينات نخر قوية. التطوير التنظيمي600 0.3 وأقل من ناحية أخرى يقلل بشكل كبير من كفاءات التعبير العابر (95).

7 يعد اختيار الأوراق للتسلل أمرًا بالغ الأهمية لإجراء تحليلات نصف كمية كافية من BiFC في بنثاميانا. بنثاميانا تختلف الأوراق ذات الأعمار المختلفة في كفاءتها في التعبير العابر. لمقارنة كفاءات BiFC لتركيبات البناء المختلفة ، يوصى بالتسلل إلى كل تركيبة بناء في أوراق نباتات مختلفة ولكن من نفس العمر والحجم والحالة الفسيولوجية. لا ينصح باستخدام أوراق مختلفة من نفس النبات. بدلاً من ذلك ، يمكن التسلل إلى مجموعتين مختلفتين من BiFC في ورقة واحدة على جانبي الوريد الأوسط للورقة. لا يوصى بأكثر من تسللتين مختلفتين لكل ورقة كما هو الحال بالنسبة لتحليل BiFC شبه الكمي هناك حاجة لعينات من نفس منطقة الورقة (انظر الملاحظة 8).

8 تحليلات BiFC شبه الكمية ضرورية لتقييم نتائج BiFC الإيجابية. أفضل نظام لأداء التحليلات الكمية BiFC بنثاميانا خلايا البشرة ، نظرًا لأنه من السهل تصوير هذه الخلايا وعرضها ، اعتمادًا على البروتينات التي سيتم التعبير عنها ، فهي كفاءة تعبير عالية ملحوظة عندما يتم التعبير عن عينات BiFC بالاشتراك مع مثبط الإسكات p19. يوصى بتسريب العينات لمقارنتها بأوراق ذات حالة فسيولوجية مماثلة. يجب أيضًا حصاد عينات للتحليلات المجهرية أو الغربية من مناطق أوراق مماثلة. مستويات التعبير في التسلل بنثاميانا تختلف الأوراق حسب النقطة الزمنية بعد التسلل. عادة ما يكون من الممكن بالفعل اكتشاف بنيات البروتين المعبر عنها بقوة في اليوم الثاني بعد زيادة التسلل والتعبير حتى اليوم الخامس بعد التسلل. ومع ذلك ، يوصى بشدة بإجراء تحليلات BiFC نصفية فقط في الأيام 3 & # x02013 4 بعد التسلل بسبب النسبة القصوى للإشارة / الضوضاء خلال تلك المرحلة الزمنية.

كمثال لتحليلات BiFC في بنثاميانا تم التحقيق في التفاعل المعروف بين مستشعر الكالسيوم (CBL) الذي يشبه الكالسينورين ب (CBL) والبروتين المتفاعل CBL كيناز CIPK24 (الشكل 2 ، 49 ، 104). كعنصر تحكم سلبي في CIPK24NAF & # x00394 تم استخدام الإنشاء ، حيث تم حذف مجال NAF ، وهو أمر ضروري وكافي لتفاعل مستشعر الكالسيوم CBL (105). تم إجراء التصوير باستخدام مجهر متحد البؤر لقرص الغزل المقلوب. تم التقاط صور نظرة عامة أعلى دقة وإسقاطات قصوى لمكدس z بما في ذلك 32 طائرة بؤرية بهدف 60 & # x000d7 (الشكل 2 أ) وتشير إلى تشكيلات معقدة CIPK24 / CBL10 (أصفر) في الغشاء الفراغي الذي يمكن تمييزه بوضوح عن SCFP3A (سماوي) ) التوطين في السيتوبلازم والنواة. For semiquantitative analyses images were taken with a 20× objective and quantified 3 days after infiltration ( Figure 2b ). After p19 background subtraction BiFC intensities were normalized to CIPK24/CBL10 interaction. Here, the use of the NAF domain deletion construct (CIPK24NAFΔ) resulted in reduced BiFC intensities of 41 % (BiFC constructs only) and 44 % (co-expressed with SCFP3A). Normalization of the BiFC/SCFP3A (Y/C)-ratios resulted in a reduced BiFC efficiency for CIPK24NAFΔ/CBL10 of 57 %. These data indicate that compared to CIPK24 wild type protein CIPK24NAFΔ interacts less efficient with CBL10 (49, 106). For western analyses, proteins were extracted using 1× SDS sample buffer, separated in 10 % Acrylamide/Bisacrylamide SDS gels and blotted onto PVDF membranes. Immuno detection of the different BiFC and SCFP3A construct combinations resulted in comparable expression levels of the respective fusion proteins ( Figure 2c ). Samples infiltrated only with the p19 strain were used as background controls and did not exhibit a respective signal in the western blots. PageBlue staining of the large RuBisCO subunit was used as loading control.

Taken together, co-expression of a reference FP, here SCFP3A (107), is not necessarily needed for BiFC quantification in بنثاميانا but it could minimize differences in BiFC signals due to differences in expression efficiencies between different leaves or leaf areas. Semiquantitative BiFC analyses in بنثاميانا as presented in Figure 2 are only applicable for PPIs that are localized in the plasma membrane, the cytoplasm, the cytoplasm including the nucleus, the endoplasmatic reticulum and the tonoplast. Such BiFC quantifications are not applicable for smaller compartments or organelles like the nucleus, peroxisomes, chloroplasts, mitochondria and the endosomal compartments as subtraction of the background signals from entire images most likely would lead to undetectable signals. Here, signal intensities of individual organelles from different samples need to be compared.

As transient expression in أرابيدوبسيس is less robust than expression in بنثاميانا, co-expression of a reference FP is recommended for semiquantitative BiFC analyses. In addition, prior to BiFC analyses, it is recommended to infiltrate single FP-fusions of proteins, which should be investigated, to verify proper expression. Infiltration of YN-CIPK24/CBL10-YC into أرابيدوبسيس did not result in detectable BiFC signals, possibly due to silencing or inefficient expression of YN-CIPK24 (data not shown). Type 2C protein phosphatases interact with SnRK2 protein kinases (108�). Interaction of the SnRK2 kinase OST1 (112) and the PP2C phosphatase ABI1 (108, 110) was exemplarily investigated in infiltrated بنثاميانا و أرابيدوبسيس أوراق. YFP N173 was fused to the N-terminus of OST1 (YN-OST1) and YFP C155 was fused to the N-terminus of ABI1 (YC-ABI1), infiltrated into بنثاميانا و أرابيدوبسيس leaves and analyzed four and seven days after infiltration, respectively ( Figure 2d ). BiFC analyses in both plant species indicate OST1/ABI1 complex formations with similar cytoplasmic and nuclear localization patterns.

9 A representative cell ideally harbors the nucleus in the center of the cell when looking on the z-axis. The nucleus is the best orientation point in a cell because it allows to distinguish between certain localization patterns. Plasma membrane localization of fluorescent proteins or protein complexes is characterized by a fluorescence signal only at the cell border. Here, plasmolysis may allow the appearance of Hechtian strands. Endoplasmatic reticulum localization displays a ring like structure around the nucleus and a net/mesh-like architecture. The vacuolar membrane is characterized by forming a pocket around the nucleus and most likely pushing the nucleus at the cell border. Here also membraneous invaginations and cytoplasmic strands are visible, forming a tunnel system through the large central vacuole (CIPK24/CBL10 complexes in Figure 2a ). In some cases also ring like structures are visible. Cytoplasmic localization is visible by fluorescence of cytoplasmic strands. In addition to that the cytoplasm is forced in close proximity to the cell borders and the nucleus as the central vacuole occupies more than 90 % of the cell volume. Cytoplasmic proteins or protein complexes are often dually localized and also found in the nucleus (SCFP3A in Figure 2a , OST1/ABI1 complexes in Figure 2d ), except of those that have a nuclear export signal or are too large to pass the nuclear pores passively. To distinguish between plasma membrane, vacuolar membrane, cytoplasm and endoplasmatic reticulum it is recommended to search for cytoplasmic strands, fluorescence around the nucleus and to carefully analyze the architecture of the fluorescence signal at the cell border in a top or bottom cell view or in a maximum projection (see Figure 2a ). The nucleus is the largest organelle in the cell and fluorescence is often excluded from the nucleolus. The second largest organelles are chloroplasts. However compared to mesophyll cells, in epidermal cells chloroplasts are smaller and in lower quantity. Chloroplasts exhibit an elliptical structure and are often localized at the cell borders or around the nucleus. Chloroplasts can be easily visualized by chlorophyll auto-fluorescence. However, chlorophyll auto-fluorescence may also appear if too high excitation energy or exposure times are used, especially when FP or BiFC signals are weak. It is more difficult to identify other small cellular organelles like peroxisomes, the golgi apparatus or other endosomes. Here co-localization studies using fluorescent markers are recommended.

For representative images it is recommended displaying one overview image with the focal plane through the nucleus and the cell center. In addition a maximum projection of a z-stack is the first choice to visualize an entire cell, as here multiple focal planes through the cell are merged in one image (see Figure 2 ).


شاهد الفيديو: شرح طريقة مبتكرة لتعديل ورقة السكانر Scanner على PowerPoint. طريقة مضمونة 100% (أغسطس 2022).