معلومة

كيف يتم فرز الخلايا المفردة في بروتوكول scRNA-Seq بواسطة FACS؟

كيف يتم فرز الخلايا المفردة في بروتوكول scRNA-Seq بواسطة FACS؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أنا رجل حسابي أحاول فهم كيفية عمل فرز FACS في بروتوكول scRNA-Seq. حول فرز الخلايا المفردة في كل بئر من لوحة 384 جيدًا ، لدي سؤال سيكون ممتنًا إذا أمكنك الإجابة عليه.

يقرأ البروتوكول أنه يتم فرز الخلايا في الآبار بناءً على مستويات علاماتها. على سبيل المثال تقول:

تم جمع الخلايا المفردة NK من أحداث CD19- / TCR-β- عن طريق البوابات لأحداث NK-1.1 + في NK-1.1 مقابل Gr1.

الجزء الذي لا أفهمه هو كيف يمكن معرفة الأحداث الإيجابية / السلبية أو حتى الوصول إلى الأحداث مسبقًا؟ أعلم أن نظام مراقبة الأصول الميدانية يقوم أولاً بفحص العلامات ثم يقوم بفرزها إلى مجموعات إيجابية أو سلبية أو مجموعات نفايات. هذا سؤالي:

ولكن كيف لنا أن نعرف ما هو مستوى التعبير المقبول لاستدعاء خلية موجبة ، وأيضًا في حالة أكثر تعقيدًا ، كيف يمكننا الوصول إلى مجموعة سكانية فرعية من الخلايا (مثل الربع الأيمن العلوي) عندما لا تكون هناك أحداث قد عبرت بعد شعاع الليزر لأن لا نعرف خط الأساس لمستويات تعبير علامات القرص المضغوط حتى الآن؟

على سبيل المثال ، قد يكون من الممكن ألا تصل علامة القرص المضغوط في إعداد لوحتي إلى قيمة أكبر من X ، ولكن في الإعداد الخاص بك لا يمكن أن تصل أبدًا إلى قيمة أكثر من X / 2.

ملحوظة. كما يقول البروتوكول ، لا يمكن لأخذ عينات فرعية للعينة الرئيسية لنظام مراقبة الأصول الميدانية استنتاج هذه القيم مسبقًا لأنه من المحتمل جدًا ألا يتم حفظ مجموعات أنواع الخلايا المختلفة في العينة الفرعية.


سألحق الجملة السابقة في البروتوكول الخاص بك ، وأضع ما قد يساعدك بخط غامق:

للحصول على الخلايا البائية والخلايا القاتلة الطبيعية وحيدات ، تعليق الطحال كان ملطخًا بـ PE-Cy7- مترافق CD19 ، eFluor 450- مترافق NK-1.1، PerCP Cy5.5 Gr1 ، FITC TCR-βو APC CD11b و PE B220 (CD45R). تم جمع خلايا B B220 + و B220neg (مركز جرثومي) عن طريق بوابات خلايا CD19 + (TCR-βneg) ثم بواسطة B220 مقابل علامة CD19. تم جمع الخلايا المفردة NK من أحداث CD19neg / TCR-βneg عن طريق بوابة الأحداث الإيجابية NK-1.1 في NK-1.1 مقابل Gr1.

أنواع الخلايا المعنية لها خصائص فريدة يمكن تلطيخها باستخدام كيمياء الأنسجة (المناعية) ، أي المواد الكيميائية و / أو الأجسام المضادة. تميل الأجسام المضادة نفسها إلى أن تكون مترافقة ، أي أنها مرتبطة تساهميًا بالفلوروفورات التي عادة ما تكون متألقة. وهذا يعني أنه يمكن تمييز نوع الخلية عن طريق التألق ، ويمكن لآلة FACS فرز الخلايا الفلورية من الخلايا غير الفلورية.

لقد قاموا بتلطيخ أنواع الخلايا المختلفة بعلامات مختلفة. تختلف العلامات عن بعضها البعض بشكل كافٍ لتتمكن من استخدامها معًا في بعض الحالات. على سبيل المثال ، يمكن استخدام أيًا كان FITC في نفس الوقت مع الجسم المضاد المترافق PE-Cy7.

  1. أولاً ، قاموا بجمع مجموعتين فرعيتين من الخلايا البائية (الخلايا الإيجابية والسلبية B220) باستخدام علامة CD19 (الجسم المضاد المترافق PE-Cy7 الذي يربط CD19).
  2. بعد ذلك ، من إحدى المجموعات الفرعية ، المجموعة الموجبة B220 ، يقومون بفرز مجموعة فرعية أخرى تكون موجبة لـ eFluor 450 (المترافق مع الجسم المضاد NK-1.1). هذه المجموعة الفرعية المجمعة تفي بمعاييرها لكونها خلايا NK.
  3. تُستخدم هذه المجموعة الفرعية لالتقاط خلية واحدة على لوحة (على سبيل المثال لـ SMART-seq2) أو باستخدام موائع جزيئية (على سبيل المثال لـ 10x Chromium).

بالنسبة لجهاز FACS ، يمكنك تحديد مستوى العتبة على سبيل المثال الإزهار الذي سيتم استخدامه كقطع بين الأحداث الإيجابية والسلبية (الخلايا). هذا تعسفي ويخضع عادة للمحاكمات.


لا نعرف خط الأساس لمستويات تعبير علامات القرص المضغوط حتى الآن؟

هناك إعدادات قياسية يمكن استخدامها بين عمليات التشغيل والتي ستعطي نتائج متسقة من عينة إلى أخرى. هناك أيضًا عناصر تحكم (خرزات فلورية) يمكن تشغيلها مسبقًا لضبط الجهاز لضمان عمل تلك الإعدادات القياسية ، والتي تتيح لك إجراء تعديلات طفيفة نسبيًا لجعلها في نطاق ثابت.

لكن لديك أيضًا سوء فهم آخر:

لا يمكن لأخذ عينات فرعية للعينة الرئيسية لنظام مراقبة الأصول الميدانية استنتاج هذه القيم مسبقًا لأنه من المحتمل جدًا ألا يتم حفظ مجموعات أنواع الخلايا المختلفة في العينة الفرعية.

لا يعني عدم وجود الخلايا الموجبة في العينة الفرعية أنه لا يمكنك تعيين قيم عادية.

المفتاح هو أن الخلية الإيجابية ليست شيئًا دقيقًا. في صبغة قياس التدفق الخلوي النموذجية ، ستكون خلاياك المصبوغة بشكل إيجابي أكثر إشراقًا من السلبيات ؛ في أسوأ الأحوال عشرات المرات ، وغالبًا أكثر سطوعًا بآلاف المرات. سيضمن إعداد بوابة قريبة إلى حد ما من الطرف العلوي من السلبيات (في العينة الفرعية) من الناحية العملية أن تكون إيجابياتك خارج البوابة.

لقد حصلت على مثال عشوائي من بحث Google ؛ هذه بوابة ذات مظهر نموذجي:

لاحظ أنه في كل بوابة ، يكون عدد السكان الموجب (مقلة العين) ألف مرة ، إلى عدة آلاف من المرات ، أكثر سطوعًا من السالب (المحور X هو مقياس لوغاريتمي). عندما يكون لديك مساحة كبيرة للعمل بها ، يمكن تجاهل التأثيرات الدقيقة الدقيقة في إعدادات الخطوط الأساسية بأمان.


مقدمة لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية

خلال العقد الماضي ، أحدثت طرق التسلسل عالية الإنتاجية ثورة في مجال علم الأحياء بأكمله. إن فرصة دراسة النسخ الكاملة بتفصيل كبير باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) قد غذت العديد من الاكتشافات المهمة وهي الآن طريقة روتينية في البحث الطبي الحيوي. ومع ذلك ، عادةً ما يتم إجراء RNA-seq "بكميات كبيرة" ، وتمثل البيانات متوسط ​​أنماط التعبير الجيني عبر آلاف إلى ملايين الخلايا ، وهذا قد يحجب الاختلافات ذات الصلة بيولوجيًا بين الخلايا. يمثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) نهجًا للتغلب على هذه المشكلة. من خلال عزل الخلايا المفردة ، والتقاط نسخها ، وإنشاء مكتبات التسلسل التي يتم فيها تعيين النصوص للخلايا الفردية ، يسمح scRNA-seq بتقييم الخصائص البيولوجية الأساسية لمجموعات الخلايا والأنظمة البيولوجية بدقة غير مسبوقة. هنا ، نقدم بروتوكولات scRNA-seq الأكثر شيوعًا المستخدمة اليوم وأساسيات تحليل البيانات ومناقشة العوامل المهمة التي يجب مراعاتها قبل تخطيط وتصميم مشروع scRNA-seq. © 2018 بواسطة John Wiley & Sons، Inc.


5 نصائح لإنجاح تجارب تسلسل الحمض النووي الريبي أحادية الخلية

يمكن أن يكون إنشاء مكتبات RNA-seq من كتلة منخفضة جدًا من الحمض النووي الريبي في الخلايا المفردة أمرًا صعبًا. ستساعدك هذه النصائح على تجنب المشكلات الشائعة حتى تتمكن من تحقيق أقصى استفادة من تجارب RNA-seq أحادية الخلية!

1. قم بإجراء تجربة تجريبية قبل معالجة عيناتك

حتى أولئك الذين هم على دراية بسير عمل RNA-seq أحادي الخلية قد يحتاجون إلى تحسين التجارب عندما يستخدمون أنواعًا مختلفة من العينات. يمكن أن تساعد التجارب التجريبية في تحديد أي مشكلات في وقت مبكر وتجنب إضاعة الكواشف والوقت في تجارب أكبر. تتضمن التجارب التجريبية عادةً بعض العينات التجريبية وعناصر التحكم الإيجابية والضوابط السلبية. يمكن أن يساعدك أداء تفاعلات التحكم في تحديد المشكلات المتعلقة بأسلوبك التجريبي (تمت مناقشته في النصيحة 2). عندما تعمل عناصر التحكم كما هو متوقع ، يمكن أن يؤدي توزيع إنتاجية cDNA وحجمه إلى إعلام التغييرات في تجربتك للحصول على أفضل أداء من العينات التجريبية. نظرًا لأن أنواع الخلايا المختلفة يمكن أن تختلف اختلافًا كبيرًا في محتوى RNA الخاص بها ، فقد تحتاج إلى ضبط عدد دورات PCR للحصول على العائد الأمثل لإعداد مكتبة المصب.

نوع العينة محتوى RNA التقريبي (الكتلة لكل خلية)
PBMCs 1 ص
خلايا الجوركات 5 ص
خلايا هيلا 5 ص
خلايا K562 10 ص
أجنة مكونة من خليتين 500 ص

الجدول الأول: كتلة الحمض النووي الريبي لكل خلية لأنواع العينات شائعة الاستخدام.

2. قم دائمًا بردود فعل تحكم إيجابية وسلبية

سواء كنت قد قمت بإجراء RNA-seq أحادي الخلية مرة واحدة أو ألف مرة من قبل ، فإن تفاعلات التحكم هذه لا تقدر بثمن لاستكشاف تجاربك وإصلاحها. تشتمل جميع مجموعات NGS من Takara Bio على عينات تحكم إيجابية ، وأفضل تحكم إيجابي يحتوي على كتلة إدخال RNA مماثلة لعيناتك التجريبية (على سبيل المثال ، 10 بيكوغرام من الحمض النووي الريبي كنقطة انطلاق للخلايا المفردة ، أو انظر الجدول أعلاه). وبالمثل ، فإن أفضل عنصر تحكم سلبي يتم التعامل معه بنفس طريقة التعامل مع عيناتك الفعلية (على سبيل المثال ، عينة عازلة وهمية FACS). قد يرى بعض المستخدمين الجدد عائدات منخفضة (كدنا) في عينات التحكم الإيجابية الخاصة بهم. حتى تشعر بالراحة مع البروتوكول ، قد ترغب في اختبار مدخلات تحكم إيجابية (على سبيل المثال ، 10 جزء من الغرام و 100 جزء من الغرام). يمكن للمستخدمين الجدد أحيانًا رؤية خلفية عالية في عناصر التحكم السلبية ، وهي مشكلة حرجة (راجع النصائح 4 و 5 لمعرفة طرق تقليل الخلفية).

3. تأكد من تعليق الخلايا الخاصة بك في مخزن مؤقت مناسب و / أو فرزها في FACS

تتم معايرة شروط النسخ العكسي (RT) في تجارب تسلسل الحمض النووي الريبي أحادية الخلية بعناية لضمان أقصى عائد من كمية منخفضة جدًا من مادة البداية. يمكن أن يتداخل وجود الوسائط أو DEPC أو RNases أو المغنيسيوم أو الكالسيوم أو EDTA التي يتم نقلها مع الخلايا مع تفاعل RT وتقليل إنتاجية cDNA وحساسيتها. إذا كان ذلك ممكنًا ، نوصي بغسل معلق الخلية السائبة وإعادة تعليقه في EDTA- و Mg 2+ - و Ca 2+ - 1x PBS مجانًا ، خاصةً إذا كنت تستخدم تقنيات التفكك الإنزيمي مثل التربسين. إذا كنت تستخدم FACS لعزل الخلايا المفردة ، فيمكنك أيضًا إعادة تعليق الخلايا الخاصة بك في مخزن مؤقت مثل BD FACS Pre-Sort Buffer ، والذي يمكن أن يساعد في الحفاظ على الخلايا في حالة تعليق وهو أيضًا EDTA- و Mg 2+ - و Ca 2+ - مجاني . إذا كان ذلك ممكنًا ، فإننا نوصي باستخدام EDTA- و Mg 2+ - و Ca 2+ - 1x PBS كسائل غمد ، ولكن من غير المحتمل أن تؤثر سوائل الغمد الأخرى التي تحتوي على تركيزات منخفضة من EDTA على تفاعل RT.

تحتوي البروتوكولات المختلفة على توصيات مختلفة فيما يتعلق بالمخزن المؤقت والحجم المناسبين لفرز الخلايا الخاصة بك إلى FACS ، ولكن القاعدة العامة الجيدة هي الفرز في محلول تحلل طازج يحتوي على مثبط RNase. انظر الجدول أدناه للحصول على توصيات مصممة خصيصًا لمجموعات RNA-seq أحادية الخلية. إذا كانت تجربتك تتطلب منك تعديل واحد أو أكثر من هذه المعلمات ، فإن التجربة التجريبية هي أفضل طريقة لتحديد تأثير هذه الانحرافات. على سبيل المثال ، قارن بين إنتاجية (كدنا) وتوزيع حجم (كدنا) المصنوع من 10 بيكوغرام من الحمض النووي الريبي للتحكم مع وبدون كمية الوسائط أو المخزن المؤقت الذي تتوقع أن يأتي مع خلاياك.

عدة الموصى بها مجموعة FACS العازلة الصوت يتضمن مخازن جمع بديلة
SMART-Seq v4.1.0 1X رد الفعل العازلة 11.5 وماكرول تحلل العازلة ومثبط RNase & lt 5 & microl Mg 2+ - و Ca 2+ - مجاني 1X PBS
SMART-Seq HT حل فرز CDS 12.5 وماكرول محلول تحلل ، مثبط RNase ، و CDS التمهيدي 11.5 ومايكروول محلول الفرز العادي (بدون CDS oligo) أو & lt 5 & microl Mg 2+ - و Ca 2+-free 1X PBS
SMART-Seq الذين تقطعت بهم السبل ملغ 2+ - و Ca 2+ - مجاني 1X PBS 7 وماكرول محلول ملحي مخزّن بالفوسفات 8 & microl 1.25X Lysis Buffer Mixer

الجدول الثاني. معلمات مجموعة FACS الموصى بها والبديلة لمجموعات SMART-Seq v4 و SMART-Seq HT و SMART-Seq المجدولة. يتم تضمين وصفات المخزن المؤقت الدقيقة للمخازن المؤقتة لمجموعة FACS الموصى بها في أدلة المستخدم ذات الصلة. نلاحظ أن الفرز في مخزن مؤقت بديل قد يؤثر على أداء مجموعاتنا وسيتطلب تغييرات في الخلطات الرئيسية المقترحة لتفاعل RT.

4. العمل بسرعة

بمجرد إيداع الخلايا في آبار الألواح أو شرائط الأنبوب وطردها برفق عند 100ز، يجب معالجة العينات على الفور أو تجميدها بسرعة في الثلج الجاف وتخزينها في & ndash80 & degC حتى المعالجة. سيؤدي تقليل الوقت بين خطوات تجميع الخلايا والتجميد المفاجئ و cDNA إلى تقليل تدهور الحمض النووي الريبي والتغييرات غير المرغوب فيها في ملف تعريف النسخ. خلال البروتوكول ، يؤدي تقليل وقت المناولة إلى الحد من فرصة تلوث العينة أو تدهورها.

5. ممارسة تقنيات معملية جيدة RNA-seq

يعد العمل مع عينات ذات مدخلات منخفضة للغاية أمرًا صعبًا ، ومن السهل تلويث مادة العينة أو فقدها على مدار التجربة. قم دائمًا بارتداء معطف مختبر نظيف وأغطية للأكمام وقفازات طوال العملية. تذكر تغيير القفازات بين خطوات البروتوكول. ومن الممارسات الجيدة أيضًا الاحتفاظ بمساحات عمل منفصلة قبل وبعد إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل. من الناحية المثالية ، يجب أن تكون محطة عمل ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل في غرفة نظيفة مع تدفق هواء إيجابي ، مما سيقلل بشكل كبير من خطر حدوث الأمبليكون أو التلوث البيئي. يجب أن يقلل استخدام الأواني البلاستيكية الخالية من RNase و DNase ومنخفضة الحمض النووي الريبي والحمض النووي (أطراف الماصة ، والألواح / شرائط الأنبوب ، وما إلى ذلك) من فقد العينة. يمكن أن تكون خطوات تنظيف الحبيبات سببًا مهمًا آخر لفقدان العينة. تأكد من السماح للخرز بالانفصال التام قبل إزالة المادة الطافية وإلا ستفقد الكثير من المواد. سيؤدي استخدام جهاز مغناطيسي قوي إلى تحسين وتسريع هذا الفصل. بعد غسل الإيثانول ، تأكد من اتباع التوصيات الواردة في البروتوكول لأوقات التجفيف والماء.

Takara Bio هو خبير في مجال تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، وقد ابتكرنا هذه التكنولوجيا وطورناها بشكل منهجي لسنوات. نحن نقدم مجموعة من مجموعات RNA-seq أحادية الخلية ، بما في ذلك oligo-dT وحلول التحضير العشوائية. تهدف هذه النصائح إلى تقليل صعوبات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادية الخلية لديك ، ولكن إذا كانت لديك أسئلة محددة حول مجموعاتنا أو تواجه مشكلات تجريبية ، فإن فريق الدعم الفني لدينا على أهبة الاستعداد وسعد بتقديم المساعدة.

قراءة إضافية لتجارب تسلسل الحمض النووي الريبي أحادية الخلية

Haque، A.، Engel، J.، Teichmann، S.A & amp L & oumlnberg، T. دليل عملي لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية للبحوث الطبية الحيوية والتطبيقات السريرية. جينوم ميد. 9, 75 (2017).

Kolodziejczyk، A. A.، Kim، J.K، Svensson، V.، Marioni، J.C & amp Teichmann، S.A The Technology and Biology of Single Cell RNA Sequence. مول. زنزانة 58، 610 و ndash620 (2015).

Wu، A. R.، Wang، J.، Streets، A.M & amp Huang، Y. Single-Cell Transcriptional Analysis. Annu. القس الشرج. تشيم. 10، 439 و ndash462 (2017).

Takara Bio USA، Inc.
الولايات المتحدة / كندا: +1.800.662.2566 & bull Asia Pacific: +1.650.919.7300 & Bull Europe: +33. (0) 1.3904.6880 & bull Japan: +81. (0) 77.565.6999
لأغراض البحث فقط. ليس للاستخدام في إجراءات التشخيص. & نسخ 2021 Takara Bio Inc. جميع الحقوق محفوظة. جميع العلامات التجارية مملوكة لشركة Takara Bio Inc. أو الشركات التابعة لها في الولايات المتحدة و / أو البلدان الأخرى أو أصحابها المعنيين. قد لا يتم تسجيل بعض العلامات التجارية في جميع الولايات القضائية. يتوفر المنتج الإضافي والملكية الفكرية ومعلومات الاستخدام المقيد على takarabio.com.

Takara Bio Europe عضو في Takara Bio Group ، وهي شركة رائدة في علوم الحياة ملتزمة بتحسين حالة الإنسان من خلال التكنولوجيا الحيوية. من خلال علاماتنا التجارية Takara و Clontech و Cellartis ، تتمثل مهمتنا في تطوير أدوات وخدمات مبتكرة عالية الجودة لتسريع الاكتشاف.


القوة في عزلة: رؤى من خلايا مفردة

تسلط ساعة Genome Watch لهذا الشهر الضوء على مجموعة من الأساليب أحادية الخلية التي تقدم رؤى قوية في علم الأحياء الميكروبي.

على الرغم من أن تسلسل الجينوم للكائنات الدقيقة أصبح أمرًا روتينيًا الآن ، إلا أن فك شفرة كيفية ارتباط المحتوى الجينومي بالعمليات العضوية والبيئية والإيكولوجية لا يزال يمثل تحديًا كبيرًا. طبقت مجموعة من الدراسات الحديثة بنجاح مجموعة من الأساليب أحادية الخلية لربط الجينات الميكروبية والجينومات بوظائفها.

في إحدى الدراسات ، طور Doud وزملاؤه 1 إستراتيجية تسلسل الجينوم أحادي الخلية لتحديد الكائنات الدقيقة المهينة للسليلوز في مجتمع معقد. قاموا أولاً بإدخال جزيئات السليلوز التي تحمل علامات الفلورسنت على أنها "طُعم" في عينات مأخوذة من بيئة مائية طبيعية. بعد ذلك ، باستخدام فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS) وتضخيم الجينوم الكامل ، ابتكروا نهجًا مستهدفًا لصيد الكائنات الحية الدقيقة ذات الأهمية التي كانت مرتبطة بالركيزة ، مما يشير إلى أنها من المحتمل أن تتحلل من السليلوز. كشف تسلسل الجينوم الفردي للخلايا الميكروبية المرتبطة بالسليلوز الملتقطة عن وجود عضو نادر في المحيط الحيوي من كليد ضعيف التوصيف Goldbacteriaمحملة بجينات السليولاز المفترضة. ثم تحقق المؤلفون وظيفيًا من نشاط الإنزيمات المهينة للسليلوز داخل هذه السلالة الجديدة المسماة كانديداتوس "Cellulosimonas argentiregionis، والتي ستساعد في شرح الجينات المماثلة في مستودعات بيانات الجينوم البكتيري سريعة النمو.

على الرغم من أن هذا النهج يحدد بقوة الكائنات الحية الدقيقة غير المعروفة ذات الوظيفة المرغوبة داخل مجتمع معقد ، إلا أنه يتوقف على مقارنات التسلسل مع الجينات والجينومات المميزة سابقًا للتفسير الوظيفي. لمواجهة هذا التحدي ، ابتكر Thibault وزملاؤه 2 طريقة تكميلية تعتمد على خلية واحدة من خلال الاستفادة من تقنيات الموائع الدقيقة التي تم تطويرها مؤخرًا لتمكين تسلسل ترانسبوسون القطيرات (dTn-Seq). على عكس Tn-Seq التقليدية ، حيث تنمو طفرات الإدراج كمكتبات مجمعة تحت السيطرة والظروف المتغيرة ، يتيح dTn-Seq التقاط مئات الآلاف من الطفرات الفردية في القطرات الدقيقة وتنميتها في عزلة. يزيل هذا العامل المربك غالبًا في مقاربات Tn-Seq للثقافة السائبة ، حيث يمكن قمع الأنماط الظاهرية للطفرات الفردية من خلال وجود سلالات أخرى في المجتمع. على سبيل المثال ، قد تؤثر الطفرة في الجين المطلوب لإنتاج عامل استشعار النصاب المُفرز على الديناميكيات السكانية لسلالة متحولة نمت في عزلة ولكن لن يكون من الممكن اكتشافها في الثقافة السائلة المشتركة مع العديد من المسوخات الأخرى. Thibault et al. استخدم dTn-Seq لتحديد الأنماط الظاهرية لآلاف من العقدية الرئوية المسوخ. عندما نمت الطفرات في قطرات ، أصبحت مساهمات اللياقة للعديد من الجينات واضحة والتي كان من الممكن أن تُفوت إذا نمت معًا. تتوافق هذه التقنية مع تسلسل الإدخال (IN-seq) و FACS وتسلسل موقع الإدخال الموجه بواسطة الترانسبوزون (Tra-DIS) وتتبع الإدخال عالي الإنتاجية عن طريق التسلسل العميق (HITS) ، مما يتيح تطبيقه في كل من البكتيريا وحقيقيات النوى أحادية الخلية ، مثل الخمائر. يمكن أيضًا دمجها مع الفحص المجهري والتغليف المزدوج للفحص التفاعلي مع السلالات أو الأنواع الميكروبية الأخرى الموجودة في القطرات الدقيقة.

تعمل طرق علم الوراثة وعلم الجينوم على إنشاء علاقات عامة بين الجينات الميكروبية والسمات الوظيفية بنجاح. ومع ذلك ، فإن المزيد من الأفكار الكمية حول دور الجينات وشبكات تنظيم الجينات تتطلب عادةً طرقًا وظيفية في علم الجينوم ، مثل قياسات الحمض النووي الريبي المنسوخة. يجمع تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) بين عزل خلية ميكروفلويديك مع الترميز الشريطي للنسخة وتسلسلها. يتم استخدامه الآن بشكل روتيني في دراسات الكائنات متعددة الخلايا ، ولكنه يستخدم أيضًا بشكل متزايد في حقيقيات النوى أحادية الخلية. على سبيل المثال ، دراسات scRNA-seq لمسببات الأمراض المتصورة و التوكسوبلازما قدمت الأنواع نافذة مباشرة إلى المناظر الطبيعية المستنسخة لدورات حياتها الطفيلية.كشفت هذه الآراء المفككة للتغاير النسخي عبر الخلايا الفردية عن مجموعات فرعية خلوية جديدة ونقاط انتقالية ، وبالتالي كشفت عن خيوط مهمة لفهم تطور دورة الخلية والفوعة 3،4،5. لم يعد تطبيق طرق مماثلة للبكتيريا والعتائق ممكنًا لأن بروتوكولات تسلسل scRNA المعتمدة تعتمد عادةً على ذيول النسخ الممتدة متعددة الأدينيلات الموجودة في حقيقيات النوى. ومع ذلك ، مع تقدم التكنولوجيا ، من المتوقع أن تصبح طرق مماثلة متاحة للبكتيريا والعتائق ، مما يحمل وعدًا كبيرًا بنفس القدر لكشف الأسرار التي لا توصف للخلايا المفردة.


3. استخدام تقنيات الخلية الواحدة لفهم بيولوجيا الغدة الثديية

منذ نشر أول مخطوطات خلية مفردة تميز الغدة الثديية بعد الولادة [71] ، [72] ، ركز عدد متزايد من الدراسات (الجدول 1) على مقارنة الخلايا الثديية عبر مراحل مختلفة من التطور الطبيعي (الشكل 1). تركز هذه الدراسات على التوصيف الشامل للمجموعات السكانية الفرعية للخلايا الثديية ومسارات التمايز باستخدام قياس الكتلة الخلوية و scRNA-seq و scATAC-seq ، للإجابة على سؤال رئيسي مثل ما إذا كانت هناك مجموعة نادرة من الأسلاف ثنائية القدرة موجودة في الماضي التطور الجنيني.

الجدول 1

مجموعات بيانات أحادية الخلية للخلايا السرطانية والثديية الطبيعية.

المرجعيمختبرصنفنوع الأنسجة (طبيعي / سرطان / كلاهما)عينة من النقاط الزمنيةجزء الثدي (ظهاري / سدى مناعي / كلاهما)تحضير الخلايا قبل تسلسل الخلية المفردةتقنية & # x000a0 + & # x000a0technologyعدد الخلايا / النوى التي تم تحديدها
أندرسون وآخرون. bioRxiv 2020 (ما قبل الطباعة)لونديبيرجبشرسرطان8x HER2 & # x000a0 + & # x000a0 أورام الثديعلى حد سواءاختيار الخلايا مكانيا من أقسام الأنسجة الثابتةالنسخ المكانية تم تطويره بواسطة St & # x000e5hl et al. علم 20161007 بقعة (حيث تشير البقعة إلى حي صغير يسكنه عدة خلايا)
عزيزي وآخرون زنزانة 2018Pe & # x02019er و Rudenskyبشرعلى حد سواء8 مرات من سرطان الثدي الأولي وأنسجة الثدي الطبيعية المتطابقة والدم المحيطي والعقد الليمفاويةStroma-imuneخلايا CD45 + FACS مرتبةسكرنا- تسلسل باستخدام منصة inDrop47،016 خلية
باخ وآخرون اتصالات الطبيعة 2017ماريوني وخالدالفأرطبيعيتم أخذ خلايا الثدي أثناء الحمل (اليوم 14.5) والرضاعة (اليوم 6) والارتداد (اليوم 11) ومن الفئران العذراء C57BL / 6N البالغة من العمر 8 أسابيعطلائيةيتم فرز الخلايا الحية + EpCAM السلبية للنسب باستخدام FACSسكرنا- تسلسل باستخدام منصة Chromium 10x Drop-Seq23184 خلية
باخ وبنسا وآخرون. اتصالات الطبيعة 2021خالد وماريونيالفأرعلى حد سواءمجموعة بيانات تكوين الأورام: 13 x Blg-Cre Brca1f / fp53 & # x000a0 + & # x000a0 / - الفئران (30 & # x0201348 أسبوعًا ، لا شيء) و 2 x C57BL / 6N الفئران (بعمر 36 # x0201340 أسبوعًا)على حد سواءتم عزل الخلايا القابلة للحياة باستخدام مجموعة إزالة الخلايا الميتة من MACSسكرنا- تسلسل باستخدام منصة Chromium 10x Drop-Seq102829 خلية
مجموعة بيانات الحمل: 9x C57BL / 6N الفئران عند 4.5 / 9.5 / 14.5 يومًا من الحمل بالإضافة إلى 3x C57BL / 6N الفئران (بعمر 12 أسبوعًا)
بارتوشيك وآخرون. اتصالات الطبيعة 2018بيتراسالفأرسرطانأورام من فئران MMTV-PyMT عمرها 14 أسبوعًاستروما إيمونEpCAM - / CD45 - / CD31 - / NG2 - خلايا اللحمة المتوسطة المرتبة FACSسكرنا- تسلسل باستخدام Smart-Seq2768 خلية
باسلان وآخرون eLife 2020هيكسبشرسرطانتم أخذ خزعات أساسية جديدة قبل العلاج من 16 مريضًا و # x02019 مسجلين في المرحلة الثانية من التجارب السريرية التي أجرتها مجموعة الأورام بجامعة براون (BrUOG)على حد سواءتم عزل النوى وفرز FACS من أجل ploidyتحليل رقم نسخة أحادية النواة تم تطويره بواسطة Baslan et al. بروتوكولات الطبيعة 2012متوسط ​​116 نواة مفردة لكل ورم
كارلي وآخرون ياء الورم بيول الغدة الثديية 2020رودولفبشرطبيعيخلايا الحليب البشري من اثنين من المشاركينعلى حد سواءتم عزل الخلايا القابلة للحياة باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانيةسكرنا- تسلسل باستخدام منصة Chromium 10x Drop-Seq3740 خلية
Casasent et al. زنزانة 2018إدجيرتون ونافينبشرسرطان10x سرطان الأقنية فى الموقع (DCIS) وسرطان الأقنية الغازية (IDC) عينات الأورامعلى حد سواءتم تحديد الخلايا باستخدام تشريح ليزر خلية واحدةالتسلسل الطبوغرافي للخلية المفردة (TSCS، تسلسل scDNA)في المتوسط ​​129 خلية لكل مريض
تشونغ وآخرون. اتصالات الطبيعة 2017منتزهبشرسرطان11x خلية سرطانية من أنواع فرعية مختلفة من سرطان الثديعلى حد سواءتمت إزالة الخلايا الميتة باستخدام Ficoll-Paque PLUSscATAC- تسلسل باستخدام منصة Fluidigm C1515 خلية
تشونغ وآخرون. تقارير الخلية 2019واهلالفأرطبيعيخلايا الثدي من الفئران الجنينية E18 وفئران CD1 البالغة من العمر 8 أسابيعطلائيةEpCAM + / Lin - خلايا مرتبة FACSsnATAC- تسلسل7846 نواة واحدة عالية الجودة
إنجلبريشت وتويغير وآخرون. bioRxiv 2020 (ما قبل الطباعة)شيل وخالدبشرطبيعيتم هضم أنسجة الثدي من أحد المشاركين بثلاث طرق (3 & # x000a0h ضد. 16 & # x000a0h ملخص و 10 & # x000a0rpm ضد. 100 & # x000a0rpm. سرعة الاهتزاز).على حد سواءتم عزل الخلايا القابلة للحياة باستخدام مجموعة إزالة الخلايا الميتة من MACSسكرنا- تسلسل باستخدام Chromium 10x Drop-Seq11191 خلية
جاو وآخرون. اتصالات الطبيعة 2017نافينبشرسرطانخطوط خلايا سرطان الثدي للتحقق من صحة التقنية وعينة واحدة من ورم الثدي السلبي الثلاثيعلى حد سواءنوى معزولة من الورم وخطوط الخلايا المجمدةنانوجريد snRNA- تسلسل796 نواة خلية أولية
Giraddi et al. مندوب الخلية 2019Wahl and Spikeالفأرطبيعيتم عزل خلايا الثدي من اليوم 16/18 الجنيني (E16 ، E18) ، واليوم 10 بعد الولادة (P10) و 10 & # x0201316 البالغ من العمر أسبوعًا C57BL / 6 الفئرانطلائيةالخلايا المصنفة EpCAM + FACSسكرنا- تسلسل باستخدام منصات Chromium 10x Drop-Seq و Fluidigm C16060 خلية باستخدام 10x و 262 خلية باستخدام Fluidigm C1
جكونتيلا وآخرون زنزانة 2019اسيتوبشرسرطانعينات دم تحتوي على خلايا سرطانية منتشرة (CTCs) مأخوذة من 43 مريضًا مصابين بسرطان الثدي التدريجيعلى حد سواءتم تلوين CTSs الحية لـ EpCAM و HER2 و EGFR وفرزها لـ CTCsتسلسل الجينوم الكامل لخلية واحدة تم تطويره بواسطة Farlik et al. مندوب الخلية. 201589 مجموعة واحدة من CTCs و 71 مجموعة CTC من المرضى وأجهزة xenographs
جروسلين وآخرون. علم الوراثة الطبيعي 2019Griffiths و Vallot و G & # x000e9rardالفأر والإنسانسرطاننماذج الفئران المشتقة من المريض xenogrft من سرطان الثدي اللمعية والمقاومة للعلاجعلى حد سواءتم عزل الخلايا القابلة للحياة باستخدام مجموعة إزالة الخلايا الميتة من MACSscChIP-seq و scRNA-seq2728 خلية تم تحديدها بواسطة تسلسل سكرنا
هان وآخرون. زنزانة 2018قوهالفأرطبيعيتؤخذ خلايا الثدي أثناء الحمل والرضاعة والارتداد ومن الفئران C57BL / 6 العذراءعلى حد سواء*خلايا من جميع أعضاء الفئران الرئيسية بما في ذلك الغدة الثديية. * ومع ذلك ، لم يتم ذكر إزالة الغدد الليمفاوية الثديية قبل تفكك الغدة الثديية.سكرنا- تسلسل باستخدام microwell-seq61196 خلية غدة ثديية
Kanaya et al. كومون بيول 2019تشينالفأرطبيعيخلايا الثدي من الفئران BALB / CJ البالغة من العمر 9 أسابيع والتي خضعت لعملية استئصال المبيض (انقطاع الطمث الجراحي) وعولجت بالمركبة E2 و / أو PBDEعلى حد سواءتمت إزالة الخلايا الميتة باستخدام الميكروبيداتسكرنا- تسلسل باستخدام منصة Chromium 10x Drop-Seq14856 خلية
كارايفاز وآخرون اتصالات الطبيعة 2018إليسنبشرسرطان6 مرات أورام الثدي الأولية الثلاثية السلبيةعلى حد سواءتم عزل الخلايا السرطانية القابلة للحياة عن طريق الفرز FACSسكرنا- تسلسل باستخدام Smart-seq21189 خلية
كناب وآخرون. تقارير الخلية 2017طنفبشرعلى حد سواء7x خطوط خلايا سرطان الثدي و 8x عينات من أنسجة الثدي الأولية الطبيعيةعلى حد سواءغير متاحقياس الكتلة الخلوية باستخدام 35 علامة (16 خارج الخلية و 19 داخل الخلايا)لم يكشف
لي وآخرون. تقارير الخلية 2020بروجالفأرطبيعيخلايا الثدي من الشباب (3 & # x020134 شهرًا ، n & # x000a0 = & # x000a03) وكبار السن (13 & # x0201314 شهرًا ، n & # x000a0 = & # x000a04) الفئران القديمة C57BL / 6 & # x000a0Jعلى حد سواءلا أحدسكرنا- تسلسل باستخدام منصة Chromium 10x Drop-Seq13684 خلية
Lo et al. السرطانات 2020تشوالفأرطبيعيتم عزل الخلايا الثديية من النظام الغذائي العادي وعالي الدهون (HFD) الذي تم تغذيته على C57BL / 6 بعمر شهرين Brca1 -/- ص 53 +/- الفئرانستروما إيمونEpCAM - قامت FACs بفرز الخلايا اللحمية والمناعة القابلة للحياةسكرنا- تسلسل باستخدام منصة Chromium 10x Drop-Seq3892 خلية
مورو وآخرون bioRxiv 2020 (نسخة أولية 4)جارتنربشرطبيعيعزل خلايا الثدي من 28 ضعفًا من النساء قبل انقطاع الطمث بمؤشر كتلة الجسم والأعمارعلى حد سواءتم فرز الخلايا الحية (DAPI -) باستخدام CD31 - / CD45 - / EpCAM +/- / CD49f +/- and CD45 + سكرنا- تسلسل باستخدام منصة Chromium 10x Drop-Seq87793 خلية
نجوين وآخرون اتصالات الطبيعة 2018كيسينبروكبشرطبيعيتم عزل خلايا الثدي من 7x أفراد خضعوا لعمليات رأب الثدي الاختزاليةطلائيةCD31 - / CD45 - الخلايا الظهارية المخصبة بفرز FACs باستخدام CD49f و EpCAMسكرنا- تسلسل باستخدام منصات Chromium 10x Drop-Seq و Fluidigm C124،646 خلية باستخدام 10x و 868 خلية باستخدام Fluidigm C1
بال وآخرون. اتصالات الطبيعة 2017Visvaderالفأرطبيعيتم عزل الخلايا الثديية من الفئران المبكرة بعد الولادة (بعمر أسبوعين) ومنتصف البلوغ (بعمر 5 أسابيع) والبالغ الناضج (10 أسابيع ، سواء من الفئران البكر أو الحوامل).طلائيةتم إثراء الخلايا الظهارية CD45 - / CD31 - / CD24 + FACSسكرنا- تسلسل باستخدام منصات Chromium 10x Drop-Seq و Fluidigm C13308 خلية باستخدام 10x و 460 خلية باستخدام Fluidigm C1
برفولاراكيس وآخرون. تقارير الخلية 2020واتانابي وكيسنبروكالفأرطبيعيتم عزل خلايا الثدي من فئران FVB / NJ عمرها 10 أسابيععلى حد سواءفرز FACS باستخدام علامات CD31 و CD45 و EpCAM و CD49f مفصولة عن الخلايا الحية للخلايا scRNA-seq والخلايا القاعدية / اللمعية لـ scATAC-seqسكرنا- تسلسل و scATAC- تسلسل تم إجراؤه باستخدام منصات 10x Genomics Chromiumتم تحديد 26،859 خلية باستخدام scRNA-seq وتم تصنيف 23338 خلية باستخدام scATAC-seq
سالم & # x000e9n وآخرون. bioRxiv 2018 (ما قبل الطباعة)لونديبيرجبشرسرطانأقسام أنسجة الورم من 10 مرضى تم تشخيصهم بسرطان الثدي HER2 & # x000a0 + & # x000a0على حد سواءغير متاحالنسخ المكانية تم تطويره بواسطة St & # x000e5hl et al. علم 2016 وغيرها1007 بقعة مكانية
سيباستيان وآخرون. السرطانات 2020السلبالفأرسرطانتم استخراج خلايا الثدي من فئران BALB / c عمرها 10 أسابيع مع أورام ثديية مشتقة من 4T1 (نموذج تآزري لسرطان الثدي السلبي الثلاثي)ستروماباستخدام فصل الخلايا المغناطيسية ، تم تسلسل الخلايا المستنفدة CD45 أو CD45 / CD90.1 ، وكذلك الخلايا السائبة و CD140a + / EpCAM - / CD45 - / 7AAD - FACS الليفية المصنفة.سكرنا- تسلسل باستخدام منصة Chromium 10x Drop-Seq6420 خلية
صن وآخرون. J. بيول. تشيم. 2018دينغالفأرطبيعيتم عزل الخلايا الثديية من الفئران البكر بعمر 3 إلى 4 أشهر أو اليوم 12.5 من الفئران الحامل FVBطلائيةتم استبعاد الخلايا الموجبة (Lin + ، البطانية أو المناعية) باستخدام مجموعة تخصيب الخلايا الظهارية EasySeq. تم فرز الخلايا اللمعية والقاعدية FACS لاستخدام CD24 و CD29سكرنا- تسلسل باستخدام منصة Fluidigm C1239 خلية
ثونغ وآخرون. أمام. تطوير الخلية. بيول. 2020كولاسينوبشرطبيعيتم عزل خلايا الثدي من ثلاثة أضعاف عينات أنسجة الثدي الطبيعية. بالإضافة إلى ذلك ، تمت إعادة برمجة الخلايا الثديية من المرضى الثلاثة في المختبر ومتسلسلة أيضًا.على حد سواءلا أحدسكرنا- تسلسل باستخدام بروتوكولات التسلسل المتسلسل التي طورها Macosko et al. 2015.لم يكشف
كونسورتيوم تابولا موريس طبيعة سجية 2020& # x02013الفأرطبيعيالخلايا الثديية مأخوذة من عمر 3 و 18 و 21 شهرًا من الفئران C57BL / 6JNعلى حد سواء*خلايا من جميع أعضاء الفئران الرئيسية بما في ذلك الغدة الثديية. * ومع ذلك ، لم يتم ذكر إزالة الغدد الليمفاوية الثديية قبل تفكك الغدة الثديية.سكرنا- تسلسل باستخدام منصة Chromium 10x Drop-Seq15.577 خلية ثديية
توجنيتي وآخرون. bioRxiv 2020 (ما قبل الطباعة)بودنميلرخطوط الخلايا البشريةعلى حد سواء62x من خطوط خلايا سرطان الثدي و 5 x خطوط الخلايا الطبيعيةغير متاحغير متاحقياس الكتلة الخلوية باستخدام 34 علامة& # x0003e & # x000a080 مليون خلية
تويغر وآخرون bioRxiv 2020 (ما قبل الطباعة)خالد وشيلبشرطبيعي4x عينات من المشاركين الذين تبرعوا بأنسجة الثدي و 4 x عينات من اللبن البشري من النساء المرضعاتعلى حد سواءلا أحدسكرنا- تسلسل باستخدام منصة Chromium 10x Drop-Seq24666 خلية ثدي غير مرضعة و 27.023 خلية لبن بشرية
فاتر وآخرون ، تقارير الخلية 2018بودنميلر ، لابارج ولورينزبشرطبيعيتم تحديد 57 عينة تتكون من خلايا مستنبتة من 44 امرأة و 13 عينة من ظهارة الثدي غير المزروعة.الطلائيةغير متاحقياس الكتلة الخلوية باستخدام 29 علامة880.000 خلية
فاغنر في آل. زنزانة 2019بودنميلربشرعلى حد سواء144 ضعفًا من أورام الثدي البشرية و 50 ضعفًا من عينات أنسجة الثدي الطبيعيةعلى حد سواءغير متاحقياس الكتلة الخلوية باستخدام 73 علامة26 مليون خلية
وانغ وآخرون. eLife 2020شويرتفيجرالفأرطبيعيعزل خلايا الثدي من فئران ديويستروس FVB / NJ عمرها 10 أسابيعستروما إيمونتم تخصيب خلايا CD45 + لاستخدام فصل الخلايا المغناطيسيةسكرنا- تسلسل باستخدام منصة Chromium 10x Drop-Seqتم استهداف 13000 خلية
وو وآخرون. EMBO J 2020سواربريكبشرسرطان5 مرات أورام الثدي السلبية الثلاثيةعلى حد سواءتم إثراء الخلايا القابلة للحياة لاستخدامها مجموعة EasySep Dead Cell Removal Kitسكرنا- تسلسل باستخدام منصة Chromium 10x Drop-Seq24271 خلية
Wuidart et al. نات سيل بيول 2018بلانبينالفأرطبيعيتم عزل خلايا الثدي من اليوم الجنيني 14 (E14) و & # x0003e & # x000a08 الفئران البالغة من العمر أسبوعًاطلائيةتم إثراء الخلايا الجنينية CD49f Hi / Lgr5 Hi ، والكبار CD24 + / CD29 Hi القاعدية والكبار CD24 + / CD29 Lo ، الخلايا اللمعية FACSسكرنا- تسلسل باستخدام Smart-seq2193 خلية

نظرة عامة على تطور الفئران والثدي البشري ودراسات السرطان وحيدة الخلية.

3.1. تكوين الغدة الثديية الجنينية

قارنت الدراسات الحديثة بين المجموعات السكانية الفرعية للخلايا الثديية الجنينية وما بعد الولادة (الشكل 1) باستخدام scRNA-seq و ATAC-seq (الجدول 1) في محاولة للإجابة عما إذا كانت السلالات ثنائية القدرة التي تؤدي إلى ظهور كل من الخلايا اللمعية والقاعدية موجودة بعد الولادة. باستخدام تتبع النسب متعدد الألوان و scRNA-seq ، Wuidart et al. حددت أنه في اليوم الجنيني 14 (E14) توجد مجموعة واحدة من الأسلاف الجنينية متعددة القدرات (EMPs) في الغدة الثديية للفأر. تعرض هذه الخلايا توقيعًا نسخيًا هجينًا يتألف من جينات علامة من كل من الأنساب اللمعية والقاعدية [23]. في هذه الدراسة ، وجد أن p63 هو منظم رئيسي للخلايا القاعدية ، حيث يكون الإفراط في التعبير في الخلايا اللمعية كافياً لتحويلها إلى نمط ظاهري قاعدي. تتمثل إحدى قيود هذه الدراسة في أنه تم تحليل عدد صغير فقط من الخلايا عن طريق تحليل الخلية المفردة وأن المقارنات بين النقاط الزمنية التنموية المختلفة كانت محدودة (69 مخططًا للنبضات الكهرومغناطيسية مقارنة بـ 51 خلية قاعدية بالغة و 73 خلية لامعة بالغة). ومع ذلك ، في نفس العام ، تم نشر دراسة أخرى بواسطة Giraddi et al. التي قارنت ملف الخلية المفردة للخلايا أثناء التطور الجنيني (E16 و E18) ، بعد الولادة في اليوم الرابع (P4) ومن الغدة الثديية للفأر البالغ. كما لوحظ في الدراسة السابقة ، أنتجت الخلايا الثديية من E16 و E18 مجموعات منفصلة من الخلايا الجنينية ، في حين يمكن تحديد كل من الخلايا اللمعية والقاعدية بعد الولادة والتي تم فصلها بشكل أكبر في الغدة البالغة إلى مجموعات لامعة ناضجة وسخية وقاعدة منفصلة. العنقودية [73]. أظهر التحليل الأصلي لمجموعة ATAC-seq بواسطة Dravis et al. ، المشار إليه في Girraddi et al. ، أن الخلايا الجذعية الثديية الجنينية E18 (fMaSCs) قدمت ميزات مفتوحة عند المعزز البعيد ومناطق المروج القريبة لكل من الجينات اللمعية والقاعدية [74]. باستخدام نواة واحدة ATAC-seq (snATAC-seq) ، أكدت دراسات المتابعة أنه أثناء التطور الجنيني المتأخر (E18) ، أظهرت الخلايا الفردية إما شبيهة بالقاعدة (Krt5 ، Acta2) أو شبيهة بالسلف luminal / luminal (Krt8 ، Krt18 ، كيت) ملف تعريف إمكانية الوصول إلى الكروماتين جنبًا إلى جنب مع الجينات المخصبة للجنين مثل Sox10 و Sox21 [75]. بيانات snATAC-seq و scRNA-seq من Giraddi et al. تم دمجها لفحص مسار النمو الذي وجد أن الخلايا الجنينية E16 و E18 تظل متجمعة بإحكام. في حين تم العثور على الخلايا العنقودية في E18 لا يمكن تمييزها على مستوى النسخ ، تم العثور على تمهيد السلالة باستخدام snATAC-seq ، حيث عرضت الخلايا إمكانية الوصول إما إلى مصير الخلية اللمعية أو القاعدية [75]. في وقت لاحق ، كانت الخلايا اللمعية أو القاعدية المقيدة بعد الولادة موجودة فقط ، والتي عند بداية البلوغ تنقسم الخلايا اللمعية إلى الخلايا اللمعية اللامعة والخلايا اللمعية المستجيبة للهرمونات (انظر الجدول 2 للحصول على ملخص للتسميات المستخدمة بشكل شائع لهؤلاء السكان).

الجدول 2

ملخص لتسمية الأنواع الفرعية للخلايا الظهارية الثديية البالغة.

بصل لامعة
المرجعيالكائن الحيتقنيةبصلالسلف اللمعيسنخي إفرازيهرمون يستجيب
باخ وآخرون 2017الفأرسكرنا- تسلسلبصلالسلف اللمعيمتمايزة السنخية الإفرازيةاستشعار الهرمونات
تشونغ وآخرون. 2019الفأرsnATAC- تسلسلبصلالسلف اللمعيأ ناضجة اللمعية
إنجلبريشت وآخرون. 2020بشرسكرنا- تسلسلالقاعدية / ظهارة عضلية (BA)أسلاف مستقبلات الهرمون اللمعي (LHR -)أ الخلايا الناضجة الموجبة لمستقبلات الهرمون اللمعي (LHR +)
Giraddi et al. 2018الفأرسكرنا- تسلسلبصلالسلائف السنخيةأ ناضجة اللمعية
هان وآخرون. 2018الفأرسكرنا- تسلسلالخلايا العضلية الظهاريةالسلف اللمعياللمعة الأقنيةالحويصلات الإفرازيةن.
كناب وآخرون. 2017بشرقياس الكتلة الخلويةالخلايا القاعدية (BCs)أسلاف اللمعة (LPs)الخلايا اللمعية (LCs)
لي وآخرون. 2020الفأرسكرنا- تسلسلعضلي ظهاريHS-AVسنخي (AV)أ استشعار الهرمونات (HS)
مورو وآخرون 2020بشرسكرنا- تسلسلالقاعدية / عضلي الظهارةإفرازي لامعأ الهرمون المستجيب (HR +)
نجوين وآخرون 2017بشرسكرنا- تسلسلبصلعضلي ظهاريإفرازي من النوع L1أ الهرمون المستجيب من النوع L2
بال وآخرون. 2017الفأرسكرنا- تسلسلالقاعدية / عضلي الظهارةالخلايا الجذعية للثدي (MaSCs)السلف اللمعيمتوسط ​​اللمعة (Lum Int)اللسان وسقف الفماللمعة الناضجة / الأقنية
برفولاراكيس وآخرون. 2020الفأرscRNA-seq / scATAC-seqعضلي ظهاريإفراز اللمعة (L -sec)هرمون يستجيب
السلف اللمعيسلف الرضاعة / السلائفسنخي إفرازي
ريجان وسمالي 2020ن.ن.الخلايا العضلية الظهاريةمستقبلات هرمون الاستروجين سلبية (ER -) الخلايا الأقنيةالخلايا السنخية الإفرازيةالخلايا الإيجابية لمستقبلات هرمون الاستروجين (ER +) المستجيبة للهرمونات
صن وآخرون. 2018الفأرسكرنا- تسلسلعضلي الظهارة / القاعديةالخلايا اللمعية التكاثرية (PLCs)الخلايا اللمعية المتقرنة (KLCs)الخلايا اللمعية الناضجة (LCs الناضجة)الخلايا اللمعية الاصطناعية الدهنية (LBLCs)الخلايا اللمعية المستجيبة للمحفزات (SRLCs)
الخلايا القاعدية التكاثرية (PBs)إشارات WNT - تستجيب الخلايا القاعدية (WRBCs)الخلايا الجذعية للثدي (MaSCs)
ثونغ وآخرون. 2020بشرسكرنا- تسلسلعضلي ظهاريLuminal 1 (L1)أ Luminal 2 (L2)
تويغر وآخرون 2020بشرسكرنا- تسلسلالخلايا القاعدية (BA)السلف اللمعي (LP)سنخي إفرازيهرمون الاستجابة (HR)
Luminal 1 (LC1)Luminal 2 (LC2)
فاتر وآخرون 2018بشرقياس الكتلة الخلويةالظهارة العضلية القاعدية (MEP)الظهارة اللمعية (LEP)
Wuidart et al. 2018الفأرسكرنا- تسلسلالخلايا القاعدية (BCs)الخلايا اللمعية (LCs)

3.2 تكوين الخلايا الظهارية بالغدة الثديية

حتى من خلال التغييرات الدراماتيكية التي تحدث أثناء الحمل والرضاعة والارتداد في الغدة الثديية البالغة ، فإن نتائج scRNA-seq من Bach et al. دعم النتائج التي تشير إلى وجود أسلاف مقيدة النسب فقط بعد الولادة. تم تمييز الخلايا الظهارية المأخوذة من الفئران البكر ، والحوامل ، والمرضعة ، والفاشية ، لإيجاد مجموعات سكانية فرعية متميزة من الخلايا من السلالات اللمعية أو القاعدية [71]. تم ترتيب مجموعات الخلايا هذه على طول مسار الزمن الكاذب ووجد أن كلا من الخلايا اللمعية والقاعدية لم يكن لها سلف مشترك [71]. ومع ذلك ، وجد أن الخلايا اللمعية لديها سلسلة متصلة من التمايز النابع من Aldh1a3 + السلالات اللمعية وتمتد إلى السلالتين الرئيسيتين للسنخية الإفرازية والهرمونات المستجيبة. من الواضح أن تكرار مثل هذه التجارب على البشر سيكون أمرًا صعبًا ، ومن ثم فإن الدراسات التي أجريت على تسلسل scRNA لخلايا اللبن البشرية قد قدمت نتائج جديدة حول نضج خلايا الثدي البشرية الوظيفية أثناء الرضاعة [76] ، [77]. وجد العمل الأخير من مختبرنا لفحص خلايا الحليب من 4 متبرعين و 4 عينات من أنسجة الثدي غير المرضعة مجموعتين من الخلايا الإفرازية المشتقة من الحليب اللمعي والتي تشبه نسبيًا الخلايا السلفية اللمعية من الثدي غير المرضع [76]. يشير هذا العمل إلى أن السلالات اللمعية قد تؤدي إلى ظهور خلايا سنخية إفرازية في البشر ، وكذلك في الفئران. علاوة على ذلك ، وجدت دراسة أخرى نشرت مؤخرًا أن التمايز الشاذ للخلايا السلفية اللمعية ، مما يؤدي إلى التعبير عن بروتينات الحليب الرئيسية لالبا, CSN2 و الواب ، قد يوفر مؤشرا على تكوين الأورام المبكر في نماذج الفئران Brca / p53 [78]. وهذا يسلط الضوء على أهمية حل الدور الذي تلعبه الأسلاف اللمعية في التطور لفهم تطور سرطان الثدي بشكل أفضل. تتفق نتائج السلف اللمعي المشترك في الغدة الثديية البالغة مع النتائج التي توصل إليها Giraddi et al. ولكن على النقيض من دراسات تتبع النسب الأخيرة التي تشير إلى أن هذين السلالتين من الخلايا اللمعية غير فعالين في الفئران البالغة [22] ، [79] ، [80] ، [81] ، [82]. من الممكن أن تكون الخلايا اللمعية ثنائية القدرة التي تم تحديدها في دراسات scRNA-seq نشطة خلال المراحل المبكرة للجنين وما قبل البلوغ ، وفي وقت لاحق من التطور ، يتم الحفاظ على السلالتين اللامعتين من قبل أسلافهما. من المثير للاهتمام ، أنه وجد أن التكافؤ يسببه Aldh1a3 + توجد الخلايا السلفية اللمعية بعد الانقلاب ، والتي كانت على ما يبدو مهيأة نحو السلالة السنخية وعبرت عن العديد من الجينات المرتبطة بالإرضاع مثل ليبا ، Xdh والجينات الكازين مثل CSN2 و Csn3 [71]. النتائج المستخلصة من دراسة حديثة جمعت بين scATAC-Seq و scRNA-seq لدراسة فئران بالغة عمرها 10 أسابيع دعمت النتائج المستخلصة من دراسة باخ ، وتحديد مجموعة واحدة من الخلايا العضلية الظهارية بالإضافة إلى Foxa1 + هرمون استجابة السكان اللمعية و قزم 5 + /عدة + الخلايا اللمعية (تسمى L -sec للإفراز اللمعي ، انظر الجدول 2) [83]. تم تقسيم الخلايا L -sec إلى RSPO1 + / Aldh1a3 + السلف اللمعي و لالبا + / Csn2 + / ليبا + الخلايا السلفية للإرضاع والتي تشير وفقًا للتحليل الزمني الزائف إلى أن الأول يؤدي إلى النوع الفرعي للخلية الأخير [83]. كان تقييد هذه الدراسة هو أن التحليل تم إجراؤه فقط في نقطة زمنية واحدة ، حيث كانت المقارنات بين ملامح التعبير الجيني لسلف الإرضاع المكتشف والخلايا السنخية الإفرازية الموصوفة سابقًا [71] قد وضعت هذه النتائج في سياق تنموي.

تم الإبلاغ عن تجمعات خلايا مماثلة في الغدة الثديية للإنسان البالغ في نقطة زمنية واحدة [84] ، [85]. حددت القياسات الخلوية لأنسجة الثدي الأولية الطبيعية مجموعات فرعية ظهارية من الخلايا القاعدية ، اللمعية (المقابلة للخلايا اللمعية الناضجة ، انظر الجدول 2) والخلايا السلفية اللمعية [85]. اللافت للنظر ، ضمن المجموعة الأخيرة ، عرضت مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا محتوى مرتفعًا من الكاسباس 3 النشط مع الحفاظ على الاستنساخ ، مما يشير إلى احتمالية عدم استقرار جيني أكبر وزيادة خطر التحول السرطاني في هذه المجموعة من الخلايا السلفية اللمعية [85]. نجوين وآخرون حدد أيضًا 3 أنواع رئيسية من الخلايا الظهارية باستخدام scRNA-seq والتي أطلقوا عليها اسم الخلايا الظهارية 1 (L1) والخلايا اللمعية 2 (L2) (انظر الجدول 2). ال SLPI + تم تقسيم السكان L1 إلى ELF5 + /عدة + L1.2 (تشبه الخلايا السلفية اللمعية ، الجدول 2) وخلايا LTF + L1.1 (تشبه الخلايا السنخية الإفرازية ، الجدول 2). تم العثور على الخلايا السلفية اللمعية L1.2 فوق أنواع الخلايا اللمعية الأخرى في التسلسل الهرمي للتمايز. أعربت خلايا L2 عن العلامة ANKRD30A جنبا إلى جنب مع مستقبلات الهرمون ESR1, PGR و AR دلالة على السكان الفرعية المستجيبة للهرمونات (الجدول 2). ومن المثير للاهتمام ، عند إجراء فحص دقيق للمجموعة القاعدية التي تم تحديدها باستخدام 10x Genomics scRNA-seq ، وهي مجموعة فرعية من الخلايا التي يتم التعبير عنها بدرجة عالية من الجينات الانقباضية (ACTA2 ، TGLN ، KRT14) والتي حددها المؤلفون لاحقًا على أنها خلايا عضلية ظهارية معينة [84]. ومع ذلك ، تشير البيانات المأخوذة من طباعة ما قبل الطباعة الحديثة إلى أن التعبير التفاضلي لعلامات الالتصاق قد يكون نتاجًا لفترة هضم طويلة بدلاً من أن يكون ناتجًا عن مجموعات فرعية مميزة في الأنواع الفرعية لخلايا الثدي البشرية [86]. في ورقة Nguyen ، حدد المؤلفون يدويًا بداية الوقت الكاذب ليكون ضمن نوع الخلية القاعدية ووجدوا أن المسار الناتج متمايزًا من الخلايا القاعدية إلى الفرع الظهاري العضلي والفرع اللمعي المتشعب ، تعلوه السلالات Luminal L1.2 [ 84]. في حين يبدو أن الدراسات الموصوفة حتى الآن تمثل وجهة نظر متوافقة مع المجموعات السكانية الفرعية للخلايا الثديية في الغدة الثديية الجنينية وما بعد الولادة لكل من الفئران والبشر ، فقد تم نشر نتائج متناقضة [72] ، [87] ، [88] ، [89] و تمت المراجعة [90] ، [91] مما يشير إلى وجود أسلاف ثنائية القدرات موجودة بعد الولادة.

3.3 أسلاف النسب متعددة القدرات في الغدة الثديية البالغة

على غرار باخ وآخرين ، نشرت دراسة أخرى في نفس الوقت [72] بحثت في مجموعات سكانية فرعية من الخلايا الثديية بعد الولادة في الفئران في نقاط زمنية مختلفة قليلاً للنمو (ما قبل البلوغ ، والبلوغ ، والبالغ ، والحمل وكذلك مراحل مختلفة من دورة الشبق) ومع ذلك توصلوا إلى استنتاجات مختلفة. تشير النتائج المستخلصة من هذه الدراسة إلى أنه قبل سن البلوغ ، تتكون غالبية الخلايا الظهارية من النمط الظاهري القاعدية ، حيث تكون مجموعة نادرة من السكان تشبه القاعدية تعبر عن بعض السمات اللمعية إيجابية للعلامة. سي دي 55 [72]. خلال فترة البلوغ ، يتوسع هذا السكان على ما يبدو ، حيث يتوسع بعد البلوغ سي دي 55 + توجد الخلايا في الغالب في حجرة الخلية اللمعية. تم تحديد المزيد من المجموعات السكانية الفرعية اللمعية بما في ذلك الوسيطة (علامات المشاركة لكل من السلف اللمعي والخلايا المستجيبة للهرمونات) والمختلطة (معربًا عن كليهما كيت / Elf5 علامات اللمعة و اكتا / كرت 14 العلامات القاعدية) المجموعات السكانية الفرعية للخلايا [72]. مناقشة مفصلة حول هذه الدراسة ، جنبًا إلى جنب مع دراسات أخرى مبكرة من تسلسل سكرنا للثدي والتي صنفت أنواعًا جديدة من الخلايا بناءً على التعبير عن علامات مثل c-Kit (عدة) ، يمكن العثور عليها في [92]. وجدت دراسة حديثة أجريت على الفئران أيضًا مجموعة سكانية فرعية هجينة من الخلايا اللمعية ، والتي تعبر عن جينات مميزة لكل من استشعار الهرمونات (HS) والأسلاف السنخية (AV) التي يطلق عليها خلايا HS-AV ، والتي انخفضت مع تقدم العمر [93]. تعبر كل من & # x0201cintermediate & # x0201d [72] و & # x0201cHS-AV & # x0201d [93] الخلايا اللمعية عن مستويات أعلى من Prlr و استشهد من السلف اللمعية / الخلايا السنخية ، ومستويات أعلى من Csn3 و Trf من الخلايا المستجيبة للهرمونات. لي وآخرون. ذهب أبعد من ذلك وأكد باستخدام التألق المناعي هذه الخلايا السلالة اللمعية المزدوجة من خلال توضيح التلوين المشترك لمستقبلات البروجسترون مع عامل الكريات الدهنية في الحليب 8 (PR + / MFGE8 +) ومستقبلات الاستروجين مع اللاكتوفيرين (ER + / LTF +) [93]. على الرغم من تحديد أنواع الخلايا اللمعية الجديدة ، فإن Pal et al. لم يلاحظ وجود مجموعة نادرة منفصلة من الخلايا الجذعية للثدي إبكام و بروكر أو Lgr5 و Tspan8 كان متوقعا وفقا لبيانات من دراسات سابقة [72]. وبالمثل ، صن وآخرون. فحصت الخلايا الظهارية المأخوذة من فأر بالغ في حالة عذراء وحامل ولاحظت أيضًا عدم وجود مجموعة فريدة من الخلايا التي أعربت عن Lgr5 و Tspan8 [87]. النتائج من هذه الدراسة لاحظت أ سي دي إتش 5 + /بروكر + عدد الخلايا التي استقرت في الحجرة القاعدية ، والتي تكاثرت في المختبر وكان في الجسم الحي إمكانية إعادة توطين الثدي [87]. اقترح تحليل مسارات النمو أن هذا النوع من الخلايا كان في أعلى التسلسل الهرمي للخلايا الظهارية الثديية أثناء الحمل ، ولكن لم يكن هذا هو الحال في الغدة العذراء.

استخدمت دراسات المتابعة أدوات معلوماتية حيوية جديدة للمقارنة عبر مجموعات بيانات مختلفة في محاولة للتوفيق بين الاختلافات الموجودة بين دراسات الخلية المفردة حتى الآن. طورت إحدى هذه الدراسات نموذجًا يسمى Landscape of Single Cell Entropy (LandSCENT) والذي يوفر درجة فاعلية للخلايا المفردة بشكل مستقل عن استخدام علامات النسب التي استخدموها بعد ذلك لتحديد حالات الجذر لخوارزميات مسار النسب [88]. باستخدام هذه الطريقة ، أعادت هذه الدراسة تحليل مجموعة بيانات بشرية بالغة [84] ، حيث حددوا خرائط الخلايا عالية الفعالية إلى محيط المجموعات السنخية القاعدية وغير الناضجة. الخلايا الموجودة في هذه الحالة ثنائية القدرة مفرطة في التعبير عن عوامل النسخ YBX1 و ENO1 التي تورطت في مخاطر الإصابة بسرطان الثدي القاعدية وتم اقتراحها كواسمات محتملة تحدد السلالات متعددة القدرات [88]. ومع ذلك ، خلال هذه الورقة لوحظ أن البيانات من Nguyen et al. لم تكن الدراسة ذات جودة كافية لتحديد مجموعات الخلايا الجذعية بدون هذه التقنية وأن الدراسات المستقبلية يجب أن تبحث في المزيد من الخلايا على عمق أكبر. كما أجرت دراسة حديثة أيضًا مقارنات بأثر رجعي بين العديد من مجموعات البيانات ، بالإضافة إلى إنتاج مجموعة بيانات جديدة تميز خلايا رأب الثدي البشري الطبيعي من 3 متبرعين مع الخلايا المستنبتة [89]. بينما كان التركيز الرئيسي لهذه الدراسة و # x02019s على الحيز الظهاري للخلايا الثديية ، فقد التقطوا جميع التجمعات الظهارية الملحوظة جنبًا إلى جنب مع الأنواع الفرعية للخلايا اللحمية والمناعة [89]. تمت زراعة الخلايا الثديية الأولية في 2D فوق الأرومات الليفية المشععة لإعادة برمجة الخلايا بشروط [94]. بعد ذلك ، حدد المؤلفون مجموعات الخلايا الظهارية المختلفة & # x0201chybrid & # x0201d الناشئة بما في ذلك مجموعات الخلايا القاعدية / اللمعية (KRT14 + / KRT18 + ) ، الظهارية / اللحمة المتوسطة (EPCAM + /همة + ) والبعض الذي عبر عن جميع العلامات الأربعة (الخلايا الإيجابية الرباعية ، KRT14 + / KRT18 + / EPCAM + /همة + ). على وجه الخصوص ، وجدوا من خلال مقارنة بياناتهم مع الدراسات السابقة [71] ، [73] ، [84] أن الأنسجة الثديية البشرية الطبيعية تم تعيينها على أنسجة الثدييات البالغة من الفئران والخلايا المعاد برمجتها بشكل مشروط خريطة أقرب إلى التجمعات الجنينية الشبيهة بالجذع. خلايا الفأر. بعد المقارنة بكل هذه النقاط الزمنية ، لاحظوا أن الخلايا & # x0201chybrid & # x0201d كانت موجودة في نقاط زمنية مختلفة في الغالب خلال في الرحم الدورة والحمل والرضاعة. تقدم هذه الورقة نظرة أولية على جميع المجموعات السكانية الفرعية للخلايا الثديية (بما في ذلك السدى) الموجودة في الغدة الثديية البشرية البالغة ولكنها لا تأخذ في الاعتبار الاختلافات في ملامح تعبير العلامة بين الفئران والخلايا البشرية ، أي أن تعبير KRT14 قد لوحظ بشكل روتيني بواسطة علماء الأمراض في كل من الخلايا اللمعية والقاعدية في الإنسان البالغ [95]. يعد الاستخدام الدقيق للعلامات لتحديد أنواع الخلايا المختلفة أمرًا مهمًا عند وصف ما إذا كانت المجموعات السكانية الفرعية للخلية تحتوي على علامات من كل من الخلايا اللمعية والقاعدية. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم أن نتذكر أن الخلايا التي تم التقاطها في هذه الدراسات تتم في لقطة واحدة في الوقت المناسب وأن مساراتها الزمنية يتم استنتاجها فقط من هذه النقاط الزمنية الفردية. لذلك يجب التحقق من البيانات القاطعة للقدرة الحيوية باستخدام في الجسم الحي النماذج ، كما ناقشها واطسون وخالد [96] ، وقد تستفيد من التقنيات الناشئة مثل scGASTALT / LINNAEUS [97] ، [98] التي تجمع بين تتبع النسب غير المتحيز مع الندوب الجينية التي يمكن اكتشافها من تسلسل الحمض النووي الريبي.

3.4. التحديات المتبقية في وجه توليد أطلس موحد لخلية الثدي

قبل أن نحاول فهم الخلايا التي تقود تكوين سرطان الثدي ، أصبح من الواضح بشكل متزايد أننا بحاجة إلى توحيد النتائج المستخلصة من دراسات تطور الثدي حتى نتمكن من وصف المجموعات السكانية الفرعية للخلايا الثديية الموجودة عالميًا ، وما هي العلامات الخاصة بالأنواع التي تعبر عنها وتعرفها بشكل شائع التسمية لكل من هذه الأنواع الفرعية من الخلايا. تحقيقًا لهذه الغاية ، حاولنا تلخيص الدراسات الرئيسية للخلايا المفردة للثدي (الجدول 1) والتسميات الشائعة المستخدمة للأنواع الفرعية الظهارية للبالغين الأربعة (الجدول 2). لا تحدد جميع الدراسات نفس الأنواع الفرعية للثدي ، ولكن تتفق معظم الدراسات على أن المجموعات السكانية الفرعية للخلايا مثل الخلايا الشحمية أو الخلايا السنخية الإفرازية أثناء الرضاعة (انظر باخ وآخرون) قد تم تحديدها بشكل غير كامل بسبب الصعوبات في عزل الخلايا السليمة أثناء التفكك. يجب أن تستكشف الجهود المستقبلية لبناء أطلس الخلايا الثديية طرقًا مختلفة لفصل الأنسجة / عزل الخلايا ، مثل تعديل مدة الهضم [86] أو درجة حرارة الإنزيمات [99] ، للتغلب على أنواع معينة من الخلايا يتم تخصيبها أو استنفادها بشكل غير متناسب أثناء تحضير العينة.

كما هو موصوف أعلاه ، تم ملاحظة بعض المجموعات الفرعية المصنفة كخلايا طلائية بشكل لا يضاهى ، بما في ذلك Cd55 + [72] و Cdh5 + [87] مجموعات فرعية أو ZEB1 + / TCF4 + [84], همة + / EPCAM + و KRT18 + / KRT14 + الخلايا [89]. مجموعات Cd55 + و Cdh5 + تعبر بشكل كبير عن الجينات مثل أكسل و سبارك أو سي دي 36 و بيكام 1، التي ارتبطت بالأرومات الليفية والمجموعات السكانية الفرعية اللحمية البطانية [100]. يشير هذا إلى أن استراتيجية الفرز CD24 / CD29 المستخدمة ربما لم تكن كافية لاستبعاد تلوث الخلايا اللحمية. وبالمثل ، فإن مجموعة من خلايا Procr + المصنفة كخلايا قاعدية عبرت أيضًا عن بعض علامات الخلايا الحبيبية وليس كلها ، ومن ثم أقر المؤلفون أن هذه الخلايا قد تلوث الخلايا غير الظهارية [71]. مزيد من أنواع الخلايا الظهارية النادرة مثل ZEB1 + / TCF4 + الخلايا [84] ، همة + / EPCAM + الخلايا و KRT18 + / KRT14 + تم تحديد الخلايا [89] من خلال تعبير الواسم وحده ، حيث لا تشكل الخلايا عناقيد منفصلة ناتجة عن التجميع أو تحليل تقليل الأبعاد. على هذا النحو ، من دون التحقق المتعامد (مثل تلطيخ الأنسجة) ، من الصعب تحديد الصلة البيولوجية لهذه النتائج بسبب خطأ تقني محتمل مثل المشغولات المزدوجة أو اكتشاف النصوص الزائفة. من الواضح أنه من الصعب بشكل ملحوظ وصف مجموعات سكانية فرعية من الخلايا الثديية بناءً على عدد محدود من العلامات. ومن ثم ، للمضي قدمًا ، يجب تصنيف الخلايا التي تم تحديدها باستخدام تقنيات الخلية المفردة إلى مجموعات سكانية فرعية باستخدام النسخة العالمية للخلية & # x02019s ، بشكل تفضيلي باستخدام تواقيع الخلية المكونة من وفرة من الجينات المختلفة التي تم التحقق من صحتها.

في الواقع ، تعد قضية توحيد أنواع الخلايا المتنوعة عبر أعضاء مختلفة مشكلة عالمية لبيولوجيا الخلية وقد بدأت اتحادات مختلفة في فهرسة أنواع مختلفة من الخلايا باستخدام تقنيات الخلية المفردة. دراسة حديثة أجراها هان وآخرون. تميزت مجموعة من الأنسجة المختلفة بما في ذلك: الغدة الثديية والرئة والكلى والخصية والمشيمة باستخدام scRNA-seq كمورد في تطوير أطلس خلايا الفأر [101]. على وجه التحديد ، فيما يتعلق بالغدة الثديية ، تم فحص الأنسجة من أنسجة العذراء والحوامل والمرضعات والانعكاس. في حين أن العديد من النتائج الموصوفة بإيجاز تتناسب مع ما تم وصفه في الدراسات أعلاه [101] ، نظرًا لعدم إزالة العقد الليمفاوية قبل هضم الأنسجة ، فمن الصعب التمييز بين الخلايا المناعية المبلغ عنها في العقد الليمفاوية أو الأنسجة الثديية- مقيم. حاولت دراسة أخرى مماثلة أجراها كونسورتيوم تابولا موريس تمييز عدد الأعضاء المختلفة التي تتقدم في العمر [102]. تم استخراج خلايا أعضاء مختلفة وتسلسلها من الفئران بين شهر واحد إلى 2.5 سنة. ومن المثير للاهتمام ، أنه لوحظ أنه بالنسبة للغدة الثديية ، كان هناك انخفاض كبير في الخلايا التائية (والتي يمكن أن تربكها الغدد الليمفاوية التي يحتمل ألا تتم إزالتها قبل تفكك الغدة) ، وبشكل عام كان هناك تنظيم لعائلة عامل نسخ API (جونب ، جوند ، فوس) مع التقدم في العمر [102]. تسلط النتائج من هذه الدراسات الضوء على أنه من المهم النظر في عوامل خارج التطور الطبيعي مثل العمر التي قد تؤثر على المجموعات السكانية الفرعية للخلايا الثديية وملفات تعريف التعبير الجيني.

3.5 تأثير الشيخوخة وانقطاع الطمث والتكافؤ والسمنة على الغدة الثديية البالغة

تم التحقيق في تأثير الشيخوخة وانقطاع الطمث والتكافؤ والسمنة على النسب السكانية الفرعية للخلايا الثديية عبر عدد من الدراسات [93] ، [100] ، [103] ، [104]. النتائج من مقال فحص الخلايا الثديية الأولية للنساء الأصحاء باستخدام قياس الكتلة الخلوية لاحظت زيادة مرتبطة بالعمر في مجموعات سكانية فرعية معينة من الخلايا اللمعية مع انخفاض مماثل في نسب الخلايا الظهارية العضلية [104]. وبالمثل ، وجدت مقالة حديثة لفحص الغدد الثديية لدى الصغار مقارنة بالفئران المسنة أن الغدة تحتوي على نسب متغيرة وملامح تعبير جيني لكل من الخلايا الظهارية والخلايا اللحمية [93]. ومن المثير للاهتمام أنهم وجدوا زيادة في نسبة الخلايا الظهارية وكذلك تحديد زيادة في عدد الخلايا السنخية على وجه التحديد.ولوحظ أيضًا أنه في الخلايا الظهارية العضلية ، كان هناك انخفاض في مستويات التعبير عن الجينات المرتبطة بتخليق بروتين الغشاء القاعدي بالإضافة إلى زيادة في إنتاج السيتوكين الالتهابي بواسطة الخلايا البطانية والبطانية الوعائية والخلايا البلعمية [93]. تشير هذه النتائج إلى حدوث تغييرات جذرية في السدى في الخلايا المسنة والتي قد توفر بيئة مكروية مؤيدة للأورام.

نتيجة للشيخوخة ، فإن انقطاع الطمث هو عامل خطر لتطور سرطان الثدي ، وبالمثل فإن التغيرات المختلفة في المجموعات السكانية الفرعية لخلايا الثدي قد توفر آلية وراء هذه الظاهرة. في سياق انقطاع الطمث الجراحي (من خلال استئصال المبيض) ، تم فحص تأثير الاستروجين (17 بيتا استاديول ، E2) مع أو بدون التعرض للملوثات البيئية الضارة التي تسبب اضطراب الغدد الصماء (الإيثر الثنائي الفينيل متعدد البروم) على نسب تعداد الخلايا الثديية [100] . توصلت هذه الدراسة إلى وجود وفرة في الأرومات الليفية وخلايا الفم مع نسبة أقل من الخلايا الظهارية. ومع ذلك ، فإن استخدام E2 يؤدي إلى إعادة نمو الهياكل الشبيهة بالبرعم النهائي والتي تتعزز في وجود PBDE. يؤدي استخدام E2 و PBDE معًا إلى التعبير عن مستقبلات البروجسترون (PR) المستقلة عن خلايا مستقبلات هرمون الاستروجين (ER & # x003b1 ، Esr1 -) في مجموعتين من الخلايا اللمعية بالإضافة إلى زيادة في تجمعات البلاعم M2 التي من المحتمل أن تساهم في إعادة تشكيل الأنسجة الثديية وإنتاجها من بيئة مكروية مؤيدة للورم.

مجموعة أخرى من العوامل التي يعتقد أنها تغير من خطر الإصابة بسرطان الثدي تشمل التكافؤ والسمنة. مورو وآخرون في النسخة التي تم تحديثها مؤخرًا ، استكشفت الاختلافات في تكوين الغدة الثديية للإنسان نتيجة إما السمنة أو التكافؤ [103]. وجد أن التكافؤ يزيد من عدد الخلايا الظهارية العضلية والاستجابة النسخية للخلايا المستجيبة للهرمونات في الغدة الثديية ، بالإضافة إلى تغيير حجم الحويصلات الهوائية. ومن المثير للاهتمام ، أنهم وجدوا أن نسب السلف اللمعية لا يبدو أنها مرتبطة بالتكافؤ وأن الخلايا المستجيبة للهرمونات تنخفض في عدد النساء البدينات. انطلاقاً من منظور مختلف قليلاً ، درست دراسة أخرى تأثير السمنة التي يسببها النظام الغذائي عالي الدهون على الحيز الفموي للغدد الثديية في الفئران النموذجية لسرطان الثدي Brca1 - / - ، p53 +/- سرطان الثدي [105]. وجدت هذه الدراسة أن HFD تسبب في زيادة التعبير عن جينات المصفوفة خارج الخلية (Col3a1 ، Col6a3 ، Eln و سبارك) وعلامات البلاعم M2 المؤيدة للورم في الخلايا الوحيدة التي تشير إلى حدوث تغيير في وظيفة الخلايا اللحمية والبيئة الدقيقة في الفئران المعرضة للإصابة بسرطان الثدي. من هذه الدراسات ، يتضح أن بعض عوامل الخطر مثل العمر وانقطاع الطمث والسمنة تغير كل من الحالات الخلوية ونسب الأنواع الفرعية الظهارية والسدوية وتشير إلى أن التوصيف الدقيق لخلايا الفم ضروري لفهم تطور سرطان الثدي.

3.6 يعد فهم تنوع سدى الثدي جزءًا لا يتجزأ من فهم تطور سرطان الثدي

تم طرح النظريات المحيطة بسدى الثدي التي تحفز النمط الظاهري لشفاء الجروح في الثدي ذي الكثافة الشعاعية العالية ، أثناء السمنة وفي إعادة البناء بعد الرضاعة كآلية لتطور سرطان الثدي [90]. على هذا النحو ، من المهم أن نوصيف بعناية تكوينات الخلايا اللحمية الطبيعية وكيف يمكن أن تتغير عندما تكتسب الغدة الثديية النمط الظاهري الورمي. في الواقع ، وجدت دراسة مبكرة لـ scRNA-seq والتي حددت ملامح الخلايا من أورام الثدي أن العديد من الخلايا ذات النمط الظاهري الطبيعي (كما تم تحديده من خلال تقديرات الاختلافات في عدد النسخ) كانت من الخلايا المناعية [106]. أدى الاهتمام المتزايد بنسبة البلاعم للخلايا المناعية للثدي إلى قيام مجموعة واحدة بالتحقيق في مجموعة CD45 + من الغدد الثديية في الفئران البالغة من العمر 10 أسابيع. باستخدام scRNA-seq قاموا بتحديد ملف ليف -1 + تجمعات سكانية فرعية من الضامة المقيمة في الأنسجة والتي تعبر عن مستويات عالية من المصفوفة خارج الخلية التي تعيد تشكيل الجينات المرتبطة بها [107]. في الأنسجة البشرية ، التي تنشأ إما من ورم الثدي أو أنسجة الثدي الطبيعية المتطابقة ، وجد تحليل scRNA-seq لحجرة CD45 + أن المجموعات السكانية الفرعية للخلايا المناعية المحددة في الأنسجة الطبيعية كانت مجرد مجموعة فرعية صغيرة من تلك التي تم تحديدها في الأورام [108]. ومن المثير للاهتمام أنهم وجدوا في كثير من الأحيان جينات مرتبطة بالبلاعم M1 و M2 في نفس الخلية والتي كانت مرتبطة بشكل إيجابي ، مما يشير إلى أن كل حالة قد لا تكون حصرية بشكل متبادل كما كان يعتقد سابقًا وأن حالة الخلية قد توجد بدلاً من ذلك على طول سلسلة متصلة.

هناك نوع آخر من الخلايا السرطانية المهمة وهو الخلايا الليفية الثديية وعلى وجه الخصوص تشابهها مع الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs). مع التركيز على الخلايا الليفية المصنفة المستخرجة من الخلايا الثديية للفأر MMTV-PyMT سابقة التسرطن ، تم تحديد ثلاثة مجموعات رئيسية من CAFs بما في ذلك: الأوعية الدموية (vCAF ، مع مجموعة فرعية من CAFs ، cCAFs) ، مصفوفة (mCAF) و CAFs التنموية (dCAF) المرتبطة [109]. تم العثور على هذه الخلايا لتكون مميزة نسبيًا ومكانيًا ، حيث تم العثور على vCAFs من موقع حول الأوعية الدموية ، وأدت الخلايا الليفية المقيمة إلى mCAFs و dCAFs هي خلايا خبيثة خضعت للانتقال الظهاري إلى اللحمة المتوسطة [109]. من ناحية أخرى ، حددت دراسة لاحقة للتحقيق في CAFs والأرومات الليفية الطبيعية في سرطان الثدي الثلاثي السلبي (TNBC) - نمذجة BALB / C - 4T1 الثديية ، حددت 6 مجموعات سكانية فرعية من CAF [110]. تضمنت هذه المجموعات السكانية الفرعية: Ly6c1 مرتفع ، & # x003b1 -SMA مرتفع ، Cd53 مرتفع ، Crabp1 مرتفع ، Cd74 مرتفع ودراجات CAFs ، والتي تم تحديدها في الدراسة أعلاه. قارنت هذه الدراسة نتائجهم بنتائج Bartoschek et al. ووجدت أن mCAFs تم إثرائها من أجل Crabp1 ، وغيرها من العلامات التي تعبر عنها خلايا Crabp1 العالية ، مما يشير إلى أن هذه الخلايا قد تمثل مجموعات سكانية فرعية مماثلة. دراسة حديثة بواسطة Wu et al. فحصت الحيز الظهاري والسداني لأورام TNBC الأولية من 6 مرضى ووجدت بصرف النظر عن المجموعات السكانية الثانوية الطبيعية المتوقعة ، مجموعة سرطان ظهارية قاعدية ، ومجموعتان فرعيتان من CAF واثنان من المجموعات السكانية الفرعية الشبيهة بالأوعية (PVL) [111]. تضمنت المجموعات السكانية الفرعية الملحوظة: خلايا CAF الشبيهة بالأرومة الليفية العضلية (myCAFs) ، و CAFs الالتهابية (iCAFs) وخلايا PVL الناضجة وغير الناضجة. يقترح المؤلفون هنا أن الخلايا الموصوفة على أنها vCAFs في Bartoschek et al. الدراسة ، قد تكون خلايا PVL التي حددتها هذه الدراسة [111]. لم يتم تحديد جميع مجموعات CAF الفرعية عبر الدراسات ، مما يبرز الحاجة إلى مزامنة النتائج قدر الإمكان لتحديد مجموعات سكانية فرعية من الخلايا قابلة للترجمة.

3.7 تنميط أورام سرطان الثدي

تم استخدام العديد من تقنيات الخلية المفردة لفحص أورام الثدي البشرية ويمكن اعتبارها بداية أطلس خلايا سرطان الثدي. دراسة حديثة بواسطة Wagner et al. استخدم القياس الخلوي الكتلي لفحص التعبير عن 73 بروتينًا عبر 144 من أورام الثدي البشرية و 50 عينة من الأنسجة غير الورمية لتحديد مجموعات سكانية فرعية مختلفة من الخلايا [112]. وجد أنه على الرغم من النوع الفرعي للورم ، كان هناك قدر كبير من التباين الخلوي داخل الأورام الفردية. ومع ذلك ، فإن المشترك بين جميع الأنواع الفرعية لسرطان الثدي ، هو PD-1 + T-cells و PD-L1 + الضامة المرتبطة بالورم (TAMs). كما أنتجت دراسة أخرى حديثة لقياس الكتلة الخلوية أطلسًا خلويًا ، لكنها عوضاً عن ذلك فحصت 62 سلالة من خلايا سرطان الثدي وخمسة سلالات من الأنسجة السليمة [113].

تم إجراء مقارنات بين خطوط خلايا سرطان الثدي وأورام سرطان الثدي الأولية بواسطة Gao et al. باستخدام تقنية جديدة لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادية النواة [114]. على غرار Wagner et al. ، يمكن العثور على مجموعات سكانية فرعية مختلفة من الخلايا داخل ورم واحد. ومع ذلك ، من خلال فحص جميع السكان معًا ، تم تحديد مجموعة سكانية فرعية نادرة من الخلايا عالية التكاثر التي تنظم الجينات المرتبطة بسرطان الثدي [114]. بالتركيز بشكل أكبر على ستة أورام سرطانية ثلاثية سلبية ، Karaayvaz et al. وجد أنه على الرغم من أن معظم التجمعات نشأت من أورام منفصلة من مرضى مختلفين ، فقد ساهمت مجموعة واحدة من جميع عينات الورم [115]. كان لهذه المجموعة الفرعية ملف تعريف تعبير جيني مرتبط بتوقيعات متعددة لمقاومة العلاج والورم الخبيث وتميزت باستقلاب شحميات الجليكوسفينجولية النشط ومسارات المناعة الفطرية المرتبطة بها [115].

باستخدام النسخ المكانية ، Salm & # x000e9n et al. بدلاً من ذلك ، فحصت نوعًا فرعيًا آخر من سرطان الثدي ، أورام HER-2 الإيجابية ووجدت أنه من خلال دمج المعلومات الطبوغرافية من صور قسم الورم والبقع المكانية ، تسللت الخلايا المناعية إلى المناطق الغازية من السرطانات [116]. في المقابل ، أندرسون وآخرون. الذين استخدموا أيضًا النسخ المكانية ولكن بدلاً من ذلك دمج تحليل الصور مع بيانات scRNA-seq ، وجدوا أن الخلايا الظهارية ظلت معزولة عن الخلايا اللحمية المتقاطعة [117]. في العديد من الأورام ، تم فصل خلايا البلازما مكانيًا عن الخلايا البائية ، والتي وُجد أنها تتجمع بالقرب من الخلايا التائية في العديد من المرضى [117]. تم أيضًا دمج المعلومات المكانية مع تسلسل scDNA ، حيث يتم تحليل أنسجة الثدي من مرضى سرطان الأقنية فى الموقع (DCIS) مع سرطان الأقنية الغازية (IDC) ، وجد أن تطور الجينوم يحدث في القنوات قبل أن تهرب الخلايا السرطانية من الغشاء القاعدي وتبدأ في تكوين أنسجة IDC [36].

يعد تحليل جينوم الخلايا السرطانية والإبيجينوم ضروريًا لتحديد كيفية اكتساب الخلايا السرطانية للطفرات والتقدم لتصبح نقيلية. وجد استخدام HM-SNS (انظر قسم تسلسل الحمض النووي للخلية الواحدة) أن انحرافات رقم النسخ (CNA) تم الحصول عليها في المراحل الأولى من تطور سرطان الثدي السلبي الثلاثي في ​​دفعات قصيرة متقطعة بدلاً من التطور التدريجي ، كما كان يعتقد سابقًا [ 35]. ومن المثير للاهتمام أن وانج وآخرون. وجد أن الخلايا السرطانية الثلاثية السالبة لديها معدل طفرة متزايد مقارنة بخلايا ER + [29]. علاوة على نتائج Gao et al. [35] ، وجد وانغ أن ترتيبات اختلال الصيغة الصبغية نشأت مبكرًا في تطور الورم وظلت مستقرة عبر التوسع النسيلي [29]. وجدت دراسة أحدث باستخدام تحليل رقم النسخة أحادية الخلية أن الخلايا المفردة الزائفة ثنائية الصبغيات كانت موجودة عبر أنواع فرعية مختلفة من PAM50 واحتوت على تعديلات خاصة بالسرطان (مثل كسب 1q وخسارة 16q) ، مما يشير إلى الاستقرار الجيني الجوهري وتوفير ميزة تحديد محتملة يمكن أن تستخدم في تقييم مخاطر المرحلة المبكرة من المرض [118]. وجد تحليل حالات الكروماتين في نماذج طعم أجنبي مقاوم للعلاج مشتق من المريض أن مجموعة فرعية من الخلايا عبر أورام مختلفة تشترك في توقيع كروماتين مشترك يتكون من فقدان علامة كروماتين H3K27me3 [119]. ركزت دراسة أخرى فحصت الإيبيجينوم لخلايا سرطان الثدي بشكل خاص على أنماط مثيلة الحمض النووي لخلايا الورم المنتشرة ووجدت أن مواقع الربط للجذعية والنصوص المرتبطة بالتكاثر هي على وجه التحديد ميثيل ناقص الميثيل [120]. يوفر استخدام العديد من أدوات الخلية المفردة المختلفة فهمًا جديدًا حول تنوع خلايا ورم الثدي وإمكانات النمو ، ومع ذلك ، في كثير من الحالات ، قد لا يتم تحديد ملامح خلايا الثدي الطبيعية بنفس الطريقة وبالتالي لا يمكن مقارنتها. عندما قارنت التقنيات المماثلة بين الخلايا السرطانية والخلايا الثديية الطبيعية ، غالبًا ما يكون لها سمات مختلفة تمامًا ، مما يجعل من الصعب تحديد الخلايا الوسيطة وتمييز الخلية الأصلية للسرطان. تركز أعداد متزايدة من الدراسات الآن على فحص أنسجة الثدي الطبيعية من الأفراد المعرضين لخطر الإصابة بسرطان الثدي والتي قد تساعد في تحديد الخلايا الوسيطة قبل السريرية التي يمكن استهدافها للكشف المبكر عن المرض.


دراسة حالة: استخدام scRNA-seq لحل تكوّن الخلايا التغصنية

نوع الخلية المهم كدراسة حالة لهذه المراجعة هو الخلية المتفرعة (DC) لأنها صغيرة في الأعداد وغير متجانسة في مجموعات فرعية (48). تتكون الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي البشري من 90٪ من الخلايا الليمفاوية و 10٪ وحيدات و 1٪ من الخلايا المتغصنة. في تقرير حديث ، تم إجراء تسلسل scRNA باستخدام نظام 10X Genomics Chromium على 68000 خلية أحادية النواة في الدم المحيطي غير المصنفة (PBMC) من أجل تحديد مجموعات الخلايا المناعية المختلفة (7). بينما كانت هذه الدراسة قادرة على تحديد جميع مجموعات الخلايا المناعية الرئيسية الموجودة في الدم ، وجد المؤلفون صعوبة في تحديد أو حل أنواع الخلايا التي يقل تواترها عن 1٪. على الرغم من أن هذا النوع من النهج يمكن أن يوفر لقطة مفيدة للتركيب الخلوي لنسيج معين ، فقد يكون من الضروري إثراء أنواع الخلايا النادرة في العينة قبل scRNA-seq ، على سبيل المثال عن طريق الفرز المسبق باستخدام علامات السطح المعروفة أو الجديدة. في الواقع ، تم استخدام هذه الاستراتيجية مؤخرًا من قبل مجموعتين منفصلتين لتحديد السلائف البشرية للخلايا المتغصنة (ما قبل DC) في الدم المحيطي البشري (8 ، 10). ركز فيلاني وزملاؤه على سلالة الخلايا & # x02212 HLA-DR & # 43 ، والتي تتكون من DCs و monocytes معروفة في الدم (8). في دراستهم ، أجرى المؤلفون SMART-seq2 على 2400 سلالة و # x02212 HLA-DR & # 43 خلية مفردة واكتشفوا مجموعات خلايا مميزة نسبيًا يمكن تحديدها باستخدام علامات سطحية جديدة ، وبالتالي تسهيل عزلهم بواسطة FACS والتحليل اللاحق بواسطة scRNA -seq للتحقق من صحة هوية النسخ. باستخدام هذه الطريقة ، كان المؤلفون قادرين على تحديد عدة أنواع جديدة من DCs و monocytes بالإضافة إلى مجموعة جديدة من طليعة DC. بشكل منفصل ، ركزت مجموعتنا على سلالة الدم البشري & # x02212 HLA-DR & # 43 CD135 & # 43 الخلايا التي تتكون من مجموعات فرعية DC وسلائفها (10). أجرينا MARS-seq على 710 سلالة & # x02212 HLA-DR & # 43 CD135 & # 43 خلية مفردة وحددنا مجموعتين متميزتين نسبيًا من plasmacytoid DC (pDC) ، ومجموعتان فرعيتان من DC التقليدي (cDC) ، ومجموعة جديدة وجد لاحقًا أنه يشكل ما قبل DC. كشفت الاستجوابات الإضافية لهذه المجموعة الجديدة قبل DC في نخاع العظام البشري والدم المحيطي أن المقصورة السابقة للتيار المستمر تحتوي على مجموعات فرعية متميزة ملتزمة بالنسب (واحدة في وقت مبكر & # x0201Cuncommitted & # x0201D CD123 عالية ما قبل DC ، واثنين من CD45RA & # 43 CD123 مجموعات فرعية ملتزمة بنسب منخفضة مع ميزات وظيفية مميزة). تُظهر هذه الدراسات معًا أنه يمكن تطبيق منصات scRNA-seq المختلفة بنجاح على أسئلة بيولوجية مماثلة بطرق تكميلية.

نهج حسابي لتحديد نوع الخلية للخلايا المفردة غير المعروفة

قبل ظهور تقنيات scRNA-seq ، تم تحديد أنواع الخلايا عادةً باستخدام لوحة من الأجسام المضادة الموجهة ضد علامات سطح الخلية المحددة مسبقًا (غالبًا ما تسترشد بالمعرفة المسبقة لسلالة الخلية المعنية والتوافر العام للأجسام المضادة ذات الصلة). مع استمرار تقدم التقنيات ، زاد عدد العلامات لكل خلية التي يمكن قياسها باستخدام قياس التدفق الخلوي أو قياس الكتلة الخلوية من & # x0003C10 إلى & # x0003E40. يسمح هذا العدد الكبير من العلامات بتشريح التباين الخلوي بتفاصيل أكبر بكثير ، لكنه لا يزال متخلفًا كثيرًا عن مستوى الدقة الممكن باستخدام الأساليب غير المنحازة لتحديد نوع الخلية التي تستخدم تقنيات النسخ أو البروتين. في الواقع ، أصبحت تقنيات scRNA-seq قادرة الآن على قياس نسخ عدة آلاف من الخلايا الفردية في وقت قصير فقط ، وقد أتاح التقدم السريع في الأساليب الحسابية إجراء تحديد قوي لهذه الخلايا بطريقة غير متحيزة تمامًا. ومع ذلك ، فإن التحدي الرئيسي لعلماء الأحياء بعد الحصول على بيانات scRNA-seq الخاصة بهم هو معرفة كيفية تجميع البيانات و / أو إجراء تحديد الخلية. يتم الآن استخدام العديد من الخوارزميات المختلفة لتجميع بيانات الخلية المفردة ، بما في ذلك أقرب جار مشترك (SNN) (49) ، SNN-Cliq (50) ، pcaReduce (51) ، التجميع من خلال التضمين وتقليل الأبعاد (CIDR) (52) ، واحد - تجميع إجماع الخلية (SC3) (53) ، تحليل ملف تعريف الخلية الواحدة RNA-seq (SINCERA) (54) ، تحديد نوع الخلية النادرة (RaceID) (39) ، GiniClust (55) ، ونموذج متغير كامن أحادي الخلية (scLVM) ) (56). بعد تحديد مجموعات الخلايا ، يتم تحديد الجينات التي يتم التعبير عنها تفاضليًا في كل مجموعة ثم تعيينها على أنها أنواع خلايا معروفة / جديدة (استنادًا إلى المعرفة المسبقة المحتمل أن تكون متحيزة لتحديد علامات النسب).

هنا ، نستكشف استخدام الطريقة ، تحديد نوع الخلية عن طريق تقدير المجموعات الفرعية النسبية لنصوص الحمض النووي الريبي (CIBERSORT) ، في تحديد نوع خلية غير متحيز للنسخة أحادية الخلية ، حيث قمنا بتحليل الخلايا أحادية النواة في الدم البشري المحيطي (PBMC) ) بيانات scRNA-seq من دراستين مختلفتين استخدمت إما منصات 10X Genomics Chromium (7) أو SMART-seq2 (8). زينج وآخرون. أجرى تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لـ 68000 PBMC بشري باستخدام نظام 10 X Genomics Chromium (7) ، ثم جمعت الخلايا حسابيًا في 10 مجموعات فرعية منفصلة (الشكل 1A) ، وحدد أنماطًا خاصة بالكتلة للتعبير الجيني. تم الاستدلال على هوية أنواع الخلايا في كل مجموعة من خلال محاذاة الجينات الخاصة بالعنقود مع العلامات المعروفة لسكان PBMC المتميزين (الشكل 1B) ، وكذلك من خلال المقارنة مع ملف تعريف scRNA-seq لـ 11 مجموعة فرعية من PBMC المنقى. تمت مقارنة النسخ أحادية الخلية مع متوسط ​​النسخ من 11 مجموعة نقية بواسطة ارتباط سبيرمان & # x00027s. تم بعد ذلك تعيين كل خلية مفردة على نفس الهوية مثل المجموعة النقية التي كان لها أعلى ارتباط بها ، وهو نهج وجد أنه متوافق إلى حد كبير مع الأساليب التقليدية القائمة على الواسمات. لكل من التحليلين ، تم العثور على المجموعة 9 تحتوي على وحيدات و DC ، بينما احتوت المجموعة 10 على DC فقط. تم استخراج الخلايا من المجموعة 9 و 10 في وقت لاحق لمزيد من التحليل. يتم فصل الخلايا المخصصة للمجموعة 9 في 4 مجموعات فرعية منفصلة عند تحليلها بشكل أكبر باستخدام حزمة Seurat (58) (الشكل 1C). كانت هذه المجموعات الفرعية الأربعة قابلة للتحقق بصريًا على مخططات الأبعاد المخففة الموزعة العشوائية العشوائية (tSNE). tSNE ، كما استخدمه Becher et al. لتحديد المجموعات الفرعية النخاعية الفئران (4) ، تصور أوجه التشابه عالية الأبعاد للخلايا في خريطة ثنائية الأبعاد ، والتي ترسم الخلايا ذات الخصائص المتشابهة بالقرب من بعضها البعض ، مما يسمح بتفسير كل نوع من الخلايا على أساس الموقع (59 ، 60 ). تم تحديد الخلايا المفردة في البداية على أنها أنساب مختلفة عن طريق الارتباط مع مجموعات PBMC المنقى المتراكبة على مؤامرة tSNE (الشكل 1 د). تم العثور على المجموعة 2 لتشمل بشكل أساسي DC ، في حين أن المجموعات 0 و 1 و 3 تتألف أساسًا من CD14 و # 43 وحيدات. على الرغم من أن تصنيف نوع الخلية القائم على الارتباط يتوافق إلى حد كبير مع طرق التجميع ، فقد تم تحديد عدد من الخلايا الموجودة في مجموعات أحادية الخلية في الواقع على أنها DC. لحل ما إذا كانت هذه الخلايا هي بالفعل خلايا أحادية أو DC حقيقية ، أجرينا تحديد نوع الخلية عبر تحليل CIBERSORT (57) باستخدام تواقيع جينات أحادية الخلية و DC المحددة بواسطة بيانات النسخ أحادية الخلية (أي من 11 مجموعة فرعية من PBMC المنقى). أولاً ، استخرجنا CD14 & # 43 monocytes و DC وحساب متوسط ​​مستوى التعبير الجيني لكل نوع خلية. تم اختيار الجينات ذات التعبير الأقصى & # x0003E0.0001 UMI لتحليل CIBERSORT ، وتم حساب نسبة الإثراء لجينات التوقيع لكل خلية على حدة ، مما يسمح بتعيين هوية النسب وفقًا لمجموعات الجينات الأكثر ثراءً. عندما تم وضع تصنيف نوع الخلية المستند إلى CIBERSORT على مخطط tSNE ، لاحظنا توافقًا أعلى بكثير مع كل من التجميع والفصل tSNE (الشكل 1E).

شكل 1. تحديد أنواع الخلايا باستخدام بيانات scRNA-seq من نظام 10X Genomics Chromium. (أ) تجميع tSNE للخلايا المفردة في PBMC. (ب) محاذاة المجموعات مع مجموعات الخلايا المناعية المعروفة. (ج) تجميع tSNE للمجموعة المدمجة 9 و 10 والتي تم استنتاجها على أنها وحيدات و DC. (د) نوع الخلية المستنتج من الارتباط المتراكب على تمثيل tSNE للمجموعة المدمجة 9 و 10. (هـ) تصنيف نوع الخلية المعتمد على CIBERSORT المتراكب على تمثيل tSNE للمجموعة المدمجة 9 و 10.

في هذه الدراسة مع نظام 10X Genomics Chromium ، سمح استخدام المجموعات المرجعية لـ PBMC المنقى بتصنيف نسخ الخلايا المفردة غير المصنفة إلى 11 نوعًا رئيسيًا من الخلايا المناعية. قمنا بدمج DC من المجموعة 9 و 10 ثم قمنا بتجميعها في مجموعات فرعية متميزة. من المعروف أن DCs في دم الإنسان تتكون من مجموعتين من cDC (CD141 & # 43 cDC1 و CD1c & # 43 cDC2) بالإضافة إلى مجموعة فرعية من pDC (5) ، ومجموعة متميزة من سكان ما قبل DC (10). في دراستنا (10) ، قمنا بفرز مجموعات نقية من CD141 & # 43 cDC1 و CD1c & # 43 cDC2 و pDCs و pre-DCs من دم الإنسان وتوليد بيانات ميكروأري مجمعة ، والتي استخلصنا منها توقيعات جينية مميزة لكل مجموعة فرعية. قمنا بعد ذلك بالتحقق من صحة هذه التواقيع الجينية مقابل بيانات خلية مفردة SMART-seq2 المنشورة لكل من مجموعات DC الأربعة الموصوفة في Villani et al. (8). تعرضت الخلايا المفردة المجمعة من كل مجموعة لتقليل أبعاد tSNE ثم تم تجميعها في أربع مجموعات فرعية باستخدام حزمة Seurat (الأشكال 2A ، S2A). سمحت مقارنة CIBERSORT لهذه البيانات بتوقيعات الجينات المشتقة من المصفوفة الدقيقة بالاستدلال الحسابي للهويات الخلوية التي كانت متوافقة إلى حد كبير مع التصنيف بواسطة FACS (الأشكال 2 ب ، ج). تم تعيين المجموعات المصنفة من CD141 & # 43 cDC1 و CD1c & # 43 cDC2 و pDC إلى حد كبير إلى نوع الخلية المقابل بواسطة CIBERSORT ، مع تصنيف جزء صغير فقط من كل منها على أنها قبل DC (من المحتمل أن تمثل الخلايا السلفية الملتزمة بـ cDC1 أو مصائر cDC2 ، وكذلك ما قبل DC غير الملتزم الذي يشترك في أوجه التشابه المظهرية مع pDC). والأمر الأكثر إثارة للفضول هو أن غالبية الخلايا السلبية المزدوجة المصنفة كانت متوقعة قبل DC ، مما يشير إلى أن هذه المقصورة قد تحتوي على سلائف cDC حقيقية. لم يكن من الممكن تحديد بعض أنواع الخلايا حيث التقليب ص- القيم كانت & # x0003E0.05. ومع ذلك ، على الرغم من حقيقة أن فرز الخلايا للمصفوفة الدقيقة و SMART-seq2 تم إجراؤه بواسطة مختبرين مستقلين ، فقد أكد هذا العمل أن التواقيع المشتقة من ميكروأري كانت قادرة على المساعدة في تحديد النسب للخلايا المفردة SMART-seq2 عبر CIBERSORT. لذلك ، شرعنا في تطبيق نفس التوقيعات الجينية على التنبؤ بأنواع الخلايا للخلايا المفردة التي تم تحليلها باستخدام مجموعة بيانات 10X Genomics Chromium. أجرينا أولاً تقليل بُعد tSNE وتجميعه للتيار المستمر الفردي باستخدام Seurat (الشكل 2D) ، وأنواع الخلايا المستنبطة من CIBERSORT المتراكبة على مؤامرة tSNE (الأشكال 2E ، F). من بين المجموعات الثلاث التي تم إنشاؤها ، تتألف المجموعة 2 في الغالب من CD141 & # 43 cDC1. كان التجميع غير الخاضع للإشراف يتماشى مع استدلال نوع الخلية باستخدام الخلايا المصنفة ، مما يشير إلى أن التحديد التقليدي المستند إلى العلامات لـ cDC1 محدد جيدًا ويمكن التحقق من صحته باستخدام نهج خالٍ من العلامات. في المقابل ، تمثل المجموعة 0 مجموعة مختلطة من CD1c & # 43 وخلايا غير محددة ، في حين أن المجموعة 1 تتألف من خليط من خلايا pDC و pre-DC وخلايا غير محددة. تتوافق هذه النتائج مع التقارير السابقة التي تفيد بأن CD1c و # 43 cDC2 يمثلان في الواقع مجموعة غير متجانسة ذات تركيبة سيئة التوصيف (8 ، 10 ، 61) ، في حين أن pDCs تشبه النمط الظاهري لما قبل DC (ومن ثم فمن المحتمل أن تكون بعض وظائف الخلايا السلفية خاطئة. يعزى إلى pDC بسبب تلوث ما قبل DC) (10). تم تعيين المجموعة 0 والمجموعة 1 على أنها CD1c & # 43 cDC2 ، و pDC ، على التوالي (الشكل S2B). مقارنةً بـ SMART-seq2 ، أنتجت مجموعة بيانات 10X Genomics Chromium عددًا أكبر من الخلايا غير المصنفة التي تم تصنيفها على أنها غير محددة. لم يتم إثراء هذه الخلايا بشكل كبير في تواقيع cDC1 أو cDC2 أو pDC أو ما قبل DC ، مما يشير إلى أن هذه يمكن أن تكون مجموعات فرعية غير معروفة تم الحصول عليها بواسطة scRNA-seq الخالية من العلامات من الخلايا غير المصنفة.

الشكل 2. تحديد أنواع الخلايا باستخدام بيانات scRNA-seq من SMART-seq2. (أ) تجميع tSNE لمجموعات فرعية من الخلايا التغصنية. (ب) تصنيف نوع الخلية المعتمد على CIBERSORT المتراكب على تمثيل tSNE لمجموعة بيانات SMART-seq2. (ج) محاذاة مجموعات SMART-seq2 مع مجموعة بيانات ميكروأري لمجموعات فرعية DC. (د) تجميع tSNE لمجموعة DC مشتقة من مجموعة بيانات 10X Genomics Chromium. (هـ) تصنيف نوع الخلية المعتمد على CIBERSORT المتراكب على تمثيل tSNE لمجموعة DC المشتقة من مجموعة بيانات 10X Genomics Chromium. (F) محاذاة مجموعات DC مع مجموعة بيانات ميكروأري لمجموعات فرعية DC.

باختصار ، استخدمنا طريقتين مختلفتين ، ارتباط Spearman & # x00027s و CIBERSORT ، لتحديد أنواع الخلايا في مجموعة بيانات 10X Genomics Chromium PBMC. وجدنا أن أداء CIBERSORT كان أفضل قليلاً من أداء النهج القائم على الارتباط. قد يكون السبب الرئيسي لذلك هو أن CIBERSORT حدد أولاً جينات التوقيع لكل نوع خلية ، متبوعة بخطوة إضافية لانحدار الناقل لحساب درجة إثراء توقيع الجينات. في أي حال ، تستخدم كلتا الطريقتين نسخًا مجمعة كمرجع وبالتالي تعتمدان بشكل كبير على أنواع الخلايا الموجودة في مجموعة البيانات المرجعية. وفقًا لذلك ، فإن استخدام مجموعة بيانات شاملة ذات صلة مباشرة بدراسة الاهتمام سيحسن بشكل كبير دقة تحديد نوع الخلية.

تكامل البيانات وتصحيح الاختلاف الفني

مع زيادة إنتاجية البيانات التي توفرها scRNA-seq ، يمكن للباحثين الآن استخراج مجموعات البيانات الحالية لإجراء أنواع مختلفة من التحليل. ومع ذلك ، غالبًا ما تتطلب مجموعات البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة منصات scRNA-seq المختلفة تكاملًا قبل التحليل النهائي ، ويجب تصحيح التباين التقني بين مجموعات البيانات قبل دمجها. عند تطبيق scRNA-seq على عدد كبير من الخلايا ، تُجرى التجارب عادةً على دفعات ، مما يؤدي إلى تباين بارز في المقايسة يمكن أن يخفي عدم التجانس البيولوجي. على سبيل المثال ، Villani et al. تم إجراء SMART-seq2 على دفعتين منفصلتين من cDC1 و cDC2 و DC السلبي المزدوج و pDC (8) ، قبل إجراء تحليل التجميع وخفض البعد t-SNE ، والذي حدد مجموعتين فرعيتين متميزتين لكل نوع خلية إدخال (الشكل 3 أ ). كشف تراكب معلومات الدُفعات على مخطط tSNE أن هذه المجموعات الفرعية تتوافق مع عمليتي اختبار منفصلتين (الشكل 3 ب). لإزالة تأثير الدُفعة هذا ، تنفذ حزمة Seurat خوارزمية تحليل الارتباط الكنسي (CCA) ، والتي تحدد الأبعاد التي تحتوي فيها الدفعة 1 و 2 على أعلى ارتباط وتعرض الخلايا على هذه الأبعاد. بعد تطبيع CCA ، كانت نفس أنواع الخلايا من الدفعة 1 والدفعة 2 متوائمة جيدًا (الشكل 3 أ) ، مع عدم وجود فصل واضح للخلايا بين عمليات الفحص (الشكل 3 ب).

الشكل 3. تصحيح تأثير الدُفعات لمجموعة بيانات SMART-seq2. (أ) لوحظ تأثير الدُفعات في مجموعتي بيانات SMART-seq2 منفصلتين قبل تطبيع CCA ، لكن هذا لم يكن موجودًا بعد تطبيق تطبيع CCA. (ب) تتوافق مجموعات الخلايا مع مجموعة بيانات SMART-seq2 قبل تطبيع CCA. بعد تطبيق تطبيع CCA ، تداخلت كلتا دفعتين من الخلايا المفردة مع بعضها البعض.

بعد ذلك ، استخدمنا CCA لدمج بيانات الخلية الواحدة كما تم إنشاؤها بواسطة طريقة SMART-seq2 ونظام 10X Genomics Chromium. تم تحضير الخلايا المفردة المعزولة من cDC1 و cDC2 المنقى والخلايا السالبة المزدوجة ومجموعات pDC باستخدام SMART-seq2. تم إنشاء بيانات خلية واحدة من PBMCs غير المصنفة بواسطة نظام 10x Genomics Chromium وتم عزل DC فقط للتكامل مع بيانات SMART-seq2. تم استنتاج DC من تجربة 10X Genomics Chromium بناءً على تحليل CIBERSORT كما هو مذكور سابقًا. قبل تطبيع CCA ، تم فصل الخلايا من طريقة SMART-seq2 ونظام 10 X Genomics Chromium جيدًا (الشكل 4 أ) ، وتم تحديد مجموعتين فرعيتين متميزتين لكل سلالة ، مما يعكس استخدام النظامين التحليليين المختلفين (الشكل 4 ب). بعد تطبيع التقييم القطري المشترك ، أصبحت الخلايا التي تم تحليلها بواسطة كل منصة مختلطة جيدًا (الشكل 4 ج) وتم تجميعها بشكل رئيسي حسب نوع الخلية (الشكل 4 د). والجدير بالذكر أن الخلايا السلبية المزدوجة التي تم فصلها سابقًا عن الأنساب الأخرى لوحظ أيضًا أنها تندمج مع مجموعة CD1c & # 43 بعد CCA. حاولنا بعد ذلك دمج مجموعات البيانات ذات التكوين الخلوي المختلف قليلاً عن طريق إضافة وحيدات إلى بيانات 10X Genomics Chromium ، بينما لا تزال مجموعة بيانات SMART-seq2 تتألف من DC فقط. تم تجميع الخلايا بشكل أساسي حسب نوع الخلية بغض النظر عن النظام الأساسي المستخدم ، باستثناء أنه تم الآن تخصيص وحدات تحكم المجال المزدوجة السالبة لمجموعة أحادية الخلية وأن بعض خلايا CD141 & # 43 موجودة الآن في مجموعة CD1c & # 43 (الشكل 5).

الشكل 4. تصحيح التباين التقني في مجموعة بيانات مجموعة فرعية DC من مجموعات بيانات 10X Genomics Chromium و SMART-seq2. (أ) تجميع tSNE لمجموعة بيانات SMART-seq2 و 10X Genomics Chromium. (ب) تحديد نوع الخلية في مجموعات tSNE المدمجة لمجموعة بيانات SMART-seq2 و 10X Genomics Chromium. (ج) تطبيع CCA لمجموعات فرعية DC من مجموعة بيانات SMART-seq2 و 10X Genomics Chromium. (د) تحديد أنواع الخلايا بعد تطبيع CCA.

الشكل 5. تصحيح الاختلاف التقني في وحيدات ومجموعة بيانات DC الفرعية من مجموعات بيانات 10X Genomics Chromium و SMART-seq2. (أ) تجميع tSNE لمجموعات بيانات SMART-seq2 و 10X Genomics Chromium. (ب) تحديد نوع الخلية في مجموعات tSNE المدمجة لمجموعات بيانات SMART-seq2 و 10X Genomics Chromium. (ج) تطبيع CCA للوحدات الأحادية ومجموعات فرعية DC من مجموعات بيانات SMART-seq2 و 10X Genomics Chromium. (د) تحديد أنواع الخلايا بعد تطبيع CCA.

يشير تحليلنا إلى أن CCA قادر على تصحيح الإرباكات في تأثير الدُفعات عندما لا تختلف العوامل البيولوجية الأخرى بين التكرارات التجريبية. تفترض خوارزمية CCA أن البيانات من كلتا الدفعتين لها نفس التكوين الخلوي أو ما شابه. من المهم ملاحظة أن زرنيخات النحاس الكروماتية لا يزال بإمكانها إجبار الدُفعات على المحاذاة حتى لو كانت تحتوي على تركيبة خلوية غير متشابهة ، مما قد يؤدي إلى إخفاء التباين البيولوجي الحقيقي. للتغلب على هذا القيد ، يمكن استخدام خوارزمية الجار المتبادل (MNN) (62) لتحديد مجموعات الخلايا المماثلة أو & # x0201Cpairs & # x0201D الموجودة في كلتا الدفعتين. تُستخدم أزواج MNN لحساب الانجراف التحليلي بين عمليات الفحص وتعويض تأثير الدُفعات لاحقًا لجميع الخلايا الموجودة. في حالة عدم وجود أي بنية مشتركة ، يمكن أيضًا زيادة عدد الخلايا ذات التكوين المعروف (على سبيل المثال ، خط الخلية) في كل عينة لإزالة تأثيرات الدُفعة من خلال توفير مجموعة مرجعية موحدة. بينما يعتبر كل من CCA و MNN من الأدوات القوية ، فإن العديد من تقنيات التطبيع الأخرى (الحالية والمستقبلية) قد تعمل على تحسين تصحيح تأثير الدُفعات في السنوات المقبلة. ومع ذلك ، ستكون هناك حاجة لإجراء مقارنة شاملة لهذه الأساليب الجديدة باستخدام بيانات الإدخال المتغيرة من أجل تحديد أفضل الأساليب التي تناسب مجموعات البيانات.


تطبيق تسلسل سكرنا في الدماغ

يعتبر دماغ الثدييات العضو الأكثر تعقيدًا بسبب تنوعه الخلوي ، وتنوع ونطاق وظائفه وتنظيمه النسخي [92]. هدفت الدراسات السابقة إلى دراسة تنوع خلايا الدماغ من خلال عينات RNA-seq المأخوذة من مجموعات نقية من القشرة الدماغية [93 ، 94]. في الآونة الأخيرة ، يتم استخدام scRNA-seq كأداة لتقييم تعقيد الدماغ وتحديد مجموعات سكانية فرعية جديدة من الخلايا ، وتوقيعات جينية محددة ، وشبكات تنظيمية أساسية. سيوفر هذا القسم لمحة عامة عن دراسات تسلسل سكرنا ذات الصلة المتعلقة بأنواع مختلفة من خلايا الدماغ. تم سرد وصف أكثر تفصيلاً للدراسات المختارة في الجداول & # x000a0 1 و & # x200B and2 2 كما هو موضح في الشكل. & # x000a0 1.

تحديد أنواع خلايا الدماغ

يحتوي الدماغ على أنواع / أنواع فرعية من الخلايا العصبية شديدة التعقيد. تقليديا ، تم تحديد الخلايا العصبية من خلال التشكل ، والاستثارة ، والاتصال وموقع الخلية & # x02019s [95]. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام scRNA-seq لتحديد الأنواع والأنواع الفرعية العصبية المختلفة ، واكتشاف العلامات الجديدة الخاصة بالخلايا. على سبيل المثال ، Amit Zeisel et al. [8] تسلسل 3005 خلية مفردة وكشف عن 9 فئات رئيسية من الخلايا (الخلايا العصبية الهرمية S1 و CA1 ، الخلايا العصبية الداخلية ، الخلايا الدبقية قليلة التغصن ، الخلايا النجمية ، الخلايا الدبقية الصغيرة ، الخلايا البطانية الوعائية ، الخلايا الجدارية والخلايا البطانية البطانية). حدد المؤلفون علامات جينية جديدة لأنواع مختلفة من الخلايا ، على سبيل المثال ، تميزت الخلايا الهرمية S1 جم 11549 (رنا طويل غير مشفر) ، خلايا هرمية قرن آمون بواسطة سبينك 8 (مثبط سيرين بروتياز) ، و interneurons بواسطة Pnoc (بريبرونوسيسبتين).

Striatum هو جزء تحت القشرة من الدماغ الأمامي. يمكن أن يتسبب الخلل الوظيفي المخطط في العديد من الاضطرابات العصبية والنفسية ، على سبيل المثال ، مرض باركنسون ومرض هنتنغتون ، والوسواس القهري ، والتوحد [96 ، 97]. تقليديا ، تم تحديد التركيب العصبي للمخطط بواسطة معظم الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة (MSN) ومجموعة صغيرة من الخلايا العصبية الداخلية [74]. تم تصنيف MSNs من الناحية التشريحية والوظيفية إلى D1 و D2 MSNs [98] ومع ذلك ، لم يتم تقييم التنوع المخطط.

Ozgun Gokce et al. [74] استخدم طريقتان: تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ميكروفلويديك (MIC-scRNA-seq) وعزل الخلية المفردة عن طريق فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS-scRNA-seq) لتحليل النسخ من 1028 خلية مخططة مفردة. كشفت الترانسكريبتومات عن عشرة مجموعات سكانية فرعية مختلفة من الخلايا بما في ذلك الخلايا العصبية ، والخلايا النجمية ، والخلايا قليلة التغصن ، والخلايا الجذعية ، والخلايا المناعية ، والخلايا البطانية ، والأوعية الدموية. من خلال PCA القوي ، تم العثور على علامات جينية جديدة تميز بين خلايا D1 و D2 MSN.

يمكن للخلايا الجذعية العصبية (NSCs) التجديد الذاتي وإنتاج أنواع الخلايا العصبية ، بما في ذلك الخلايا العصبية والخلايا النجمية والخلايا قليلة التغصن [99 ، 100]. NSCs تحافظ على التوازن بين الدول الهادئة والمفعلة 101 ، 102. في حالة إصابة الدماغ ، سيتم تنشيط NSC الداخلي لإصلاح أنسجة المخ [103]. كانت الأعمال السابقة محدودة بسبب عدد صغير من العوامل التي تم تحليلها ومجموعات الخلايا المختلطة. لم يكن مفهوما تماما كيف تم تنشيط NSCs. في الآونة الأخيرة ، استخدمت دراستان طرق أحادية الخلية لفحص تنشيط الخلايا الجذعية للخلايا العصبية الكامنة بعد الإصابة. في إحدى الدراسات ، قام Llorens-Bobadilla وزملاؤه بالتحقيق في خصائص تنشيط NSCs الخاملة بعد إصابة الدماغ [22]. حدد المؤلفون NSCs في حالات هادئة ونشطة وكشفوا عن تقدم التنشيط باستخدام التسلسل أحادي الخلية. حددوا علامات جينية جديدة لمجموعات سكانية فرعية من NSCs ووجدوا أنه أثناء نقص تروية الدماغ ، تشرع NSCs الخاملة في التنشيط عبر إشارات غاما الإنترفيرون. أظهرت دراسة أخرى أيضًا أن إصابة الجهاز العصبي المركزي (CNS) يمكن أن تنشط خلايا CD133 + الهادئة. لوه وآخرون. [104] أظهر أن عامل نمو البطانة الوعائية (VEGF) يمكن أن ينشط CD133 + الخلايا الجذعية العصبية البطانية (NSCs) ، جنبًا إلى جنب مع عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي ، يؤدي إلى تمايز النسب العصبية والهجرة. في دراسة حديثة ، Dulken et al. [57] تسلسل 329 خلية مفردة عالية الجودة تم تصنيفها بواسطة FACS من أربعة مجموعات مختلفة [الخلايا النجمية ، والخلايا الجذعية العصبية الهادئة (qNSC) ، والخلايا الجذعية العصبية النشطة (aNSCs) ، والخلايا السليفة العصبية (NPCs)] داخل منطقة البطين الفرعي من الفئران البالغة. من خلال PCA ، كان المؤلفون قادرين على التمييز بين أنواع الخلايا الهادئة (الخلايا النجمية و qNSCs) من أنواع الخلايا النشطة والمتكاثرة (aNSCs و NPCs). ومن المثير للاهتمام ، أن المؤلفين قارنوا النسخ أحادية الخلية مع تلك الموجودة في الخلايا المماثلة [NSCs وأسلاف تضخيم العبور (TAPs)] المصنفة بعلامات خلوية مختلفة [22]. لتكون قادرًا على مقارنة مجموعات البيانات أحادية الخلية التي تمت معالجتها على دفعات مختلفة وبالتالي مع تحضيرات المكتبة غير المتشابهة وأعماق التسلسل ، Dulken et al. تعيين Llorens-Bobadilla وزملائه & # x02019 مجموعات البيانات باستخدام خط الأنابيب الخاص بهم ثم إجراء PCA مع الجينات الأكثر تنوعًا. بالإضافة إلى ذلك ، قاموا بإجراء ترتيب زائف للوقت باستخدام Monocle مع جينات ترتيب الإجماع الخاصة بهم ووجدوا تعبيرًا جينيًا ديناميكيًا مشابهًا يتعلق بهدوء وتفعيل NSCs. من خلال هذا التحليل التلوي ، كان المؤلفون قادرين على ملاحظة وجود علاقة ارتباط عالية بين NSCs من كلا الدراستين على الرغم من طرق العزل المتباينة والآثار الدفعية.

اعتُبرت الخلايا الدبقية قليلة التغصن من المجموعات السكانية المتجانسة وظيفيًا المهمة في الجهاز العصبي المركزي ، إلا أن هذه الخلايا والتشكيلات المتنوعة للخلايا # x02019 متنوعة [105]. من غير الواضح ما إذا كان التنوع في التشكل ناتجًا عن تفاعل الخلايا قليلة التغصن مع البيئة المحلية أثناء النضج أو بسبب عدم تجانسها الوظيفي الجوهري [106 ، 107]. ماركيز وآخرون. [75] عزل الخلايا المفردة من 10 مناطق مختلفة من CNS الأحداث والبالغات بواسطة FACS وسلسلة 5072 oligodendrocytes بواسطة scRNA-seq. حدد المؤلفون 13 مجموعة سكانية فرعية متميزة منها 12 تمثل مراحل تمايز من الخلايا السليفة قليلة التغصن إلى الخلايا الدبقية قليلة التغصن الناضجة. تم تحديد مراحل التمايز الدقيقة باستخدام t-SNE لتقليل الأبعاد وأداة biclustering BackSPIN2 لتحليل الوقت الزائف. وبالتالي ، باستخدام طرق scRNA-seq ، كشف المؤلفون عن ديناميكيات تمايز ونضج الخلايا قليلة التغصن.

من الصعب استجواب مشهد النسخ الأساسي للخلايا العصبية الفردية. في السابق ، كانت العديد من الدراسات التي أجريت على الخلايا العصبية البشرية البالغة منفردة تعتمد على توافر أنسجة جراحة الأعصاب المعزولة حديثًا من عينات إقليمية محدودة [109]. على الرغم من أن أنسجة جراحة الأعصاب المعزولة حديثًا هي أفضل لتحليل الخلايا العصبية المفردة ، إلا أن أنسجة ما بعد الوفاة يمكن أن توفر المزيد من عينات الإدخال. طور ليك وزملاؤه طريقة جديدة يمكنها تسلسل وتحديد كمية الحمض النووي الريبي في نوى عصبية معزولة من أدمغة ما بعد الوفاة [108]. قاموا بتشريح ست مناطق متميزة من القشرة الدماغية ، وأنتجوا 3227 مجموعة من بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادية الخلايا العصبية. بعد التجميع والتصنيف ، تم تحديد 16 نوعًا فرعيًا من الخلايا العصبية وتم تقييمها بواسطة علامات معروفة وهندسة خلوية قشرية.

تنظيم تطورات الدماغ بواسطة RNAs طويلة غير مشفرة (lncRNAs)

كشفت الدراسات عن الآلاف من lncRNAs في الترانسكريبتومات للثدييات [110]. لا يتم حفظ lncRNAs جيدًا أثناء التطور [111] ، ولكن محفزات lncRNAs يتم الحفاظ عليها أكثر من الجينات المشفرة للبروتين [112 ، 113]. تمتلك lncRNAs تعبيرًا محددًا عن الأنسجة في الدماغ البشري [114 ، 115] وقد ثبت أنها تشارك في تنظيم أمراض الدماغ واضطرابات النمو العصبي [116 ، 117]. اقترحت الدراسات السابقة المستندة إلى الأنسجة الكتلية أن مستويات التعبير عن lncRNAs أقل من تلك الموجودة في جينات تشفير البروتين [114 ، 118] ومع ذلك ، فمن غير المعروف ما إذا كان يتم التعبير عن lncRNAs عند مستويات منخفضة في جميع الخلايا [119].

درس الباحثون التعبير عن lncRNAs في خلايا دماغ الفأر المنقى ووجدوا دورها في تحديد مصير الخلايا السليفة قليلة التغصن (OPC) [120].تهدف الأساليب الحديثة الآن إلى معالجة lncRNAs في عينات scRNA-seq في الدماغ. ليو وآخرون. [119] استخدم scRNA-seq لتحليل lncRNAs في القشرة المخية الحديثة للإنسان. عزل المؤلفون الحمض النووي الريبي الكلي من 276 خلية مفردة من مراحل مختلفة من تطور القشرة المخية الحديثة للإنسان وقاموا بتحليل الترانسكريبتومات الخاصة بهم. لتقييم ما إذا تم التعبير عن lncRNAs بمستويات عالية في مجموعات سكانية فرعية من الخلايا ، استخدم المؤلفون النسبة المتوسطة lncRNA: mRNA التي تقارن متوسط ​​التعبير عن lncRNAs بالتعبير المتوسط ​​عن mRNA. مقارنةً بـ lncRNAs من الأنسجة السائبة (كان متوسط ​​lncRNA: نسبة mRNA 0.31) ، تم التعبير عن العديد من lncRNAs بكثرة في الخلايا الفردية (في الخلايا المفردة ، 32.2٪ من الخلايا & # x02019 متوسط ​​lncRNA: نسبة mRNA تجاوزت 1.0). وجد المؤلفون أن lncRNA LOC646329 تم تخصيبه في منطقة البطين ، حيث توجد معظم الخلايا الدبقية الشعاعية. متي LOC646329 تم إسقاطها ، تم تقليل انتشار خلايا U87. تشير النتائج إلى أن lncRNAs قد تنظم تكاثر الخلايا.


2.6 الطرق التجريبية

الشكل 2.3: قانون مور في النسخ النصية للخلية المفردة (الصورة مأخوذة من Svensson et al)

يعد تطوير طرق وبروتوكولات جديدة لـ scRNA-seq حاليًا مجالًا نشطًا جدًا للبحث ، وقد تم نشر العديد من البروتوكولات على مدار السنوات القليلة الماضية. تتضمن القائمة غير الشاملة ما يلي:

  • CEL-seq (Hashimshony et al. 2012)
  • CEL-seq2 (Hashimshony et al. 2016)
  • Drop-seq (Macosko et al. 2015)
  • InDrop-seq (كلاين وآخرون 2015)
  • MARS-seq (Jaitin et al. 2014)
  • SCRB-seq (Soumillon et al. 2014)
  • Seq-well (Gierahn et al. 2017)
  • Smart-seq (Picelli et al. 2014)
  • Smart-seq2 (Picelli et al. 2014)
  • STRT-seq (Islam et al. 2013)

يمكن تصنيف الأساليب بطرق مختلفة ، ولكن أهم جانبين هما تحديد الكميات و إلتقاط.

للتقدير ، هناك نوعان ، مكتمل الطول و على أساس العلامة. يحاول الأول تحقيق تغطية قراءة موحدة لكل نص. على النقيض من ذلك ، فإن البروتوكولات القائمة على العلامات تلتقط فقط إما 5’- أو 3’-end من كل RNA. اختيار طريقة القياس الكمي له آثار مهمة على أنواع التحليلات التي يمكن استخدام البيانات من أجلها. من الناحية النظرية ، يجب أن توفر البروتوكولات الكاملة تغطية متساوية للنصوص ، ولكن كما سنرى ، غالبًا ما تكون هناك تحيزات في التغطية. الميزة الرئيسية للبروتوكول القائم على العلامات هي أنه يمكن دمجها مع المعرفات الجزيئية الفريدة (UMIs) التي يمكن أن تساعد في تحسين القياس الكمي (انظر الفصل 4.6). من ناحية أخرى ، قد يؤدي التقيد بأحد طرفي النص إلى تقليل إمكانية التعيين ، كما أنه يجعل من الصعب التمييز بين الأشكال الإسوية المختلفة (آرتشر وآخرون 2016).

تحدد الإستراتيجية المستخدمة في الالتقاط الإنتاجية ، وكيف يمكن اختيار الخلايا وكذلك نوع المعلومات الإضافية إلى جانب التسلسل الذي يمكن الحصول عليه. الخيارات الثلاثة الأكثر استخدامًا هي ميكروويل-, موائع جزيئية- و قطيرة- على أساس.

الشكل 2.4: صورة لألواح ميكروويل (الصورة مأخوذة من ويكيبيديا)

بالنسبة للمنصات القائمة على أساس جيد ، يتم عزل الخلايا باستخدام ماصة أو التقاط الليزر على سبيل المثال ووضعها في آبار ميكروفلويديك. تتمثل إحدى مزايا الطرق الجيدة في إمكانية دمجها مع فرز الخلايا النشطة الفلوريسنت (FACS) ، مما يجعل من الممكن تحديد الخلايا بناءً على علامات السطح. وبالتالي ، فإن هذه الإستراتيجية مفيدة جدًا في المواقف التي يرغب فيها المرء في عزل مجموعة فرعية معينة من الخلايا للتسلسل. ميزة أخرى هي أنه يمكن للمرء التقاط صور للخلايا. توفر الصورة طريقة إضافية وتطبيق مفيد بشكل خاص هو تحديد الآبار التي تحتوي على الخلايا التالفة أو المزدوجة. العيب الرئيسي لهذه الأساليب هو أنها غالبًا ما تكون منخفضة الإنتاجية وقد يكون مقدار العمل المطلوب لكل خلية كبيرًا.

الشكل 2.5: صورة لرقاقة Fluidigm C1 96 بئر (الصورة مأخوذة من Fluidigm)

توفر منصات ميكروفلويديك ، مثل Fluidigm’s C1 ، نظامًا أكثر تكاملاً لالتقاط الخلايا ولتنفيذ التفاعلات اللازمة لتحضيرات المكتبة. وبالتالي ، فإنها توفر إنتاجية أعلى من المنصات القائمة على ميكروويل. عادةً ، يتم التقاط حوالي 10 ٪ فقط من الخلايا في منصة ميكروفلويديك ، وبالتالي فهي غير مناسبة إذا كان المرء يتعامل مع أنواع خلايا نادرة أو كميات صغيرة جدًا من المدخلات. علاوة على ذلك ، تعتبر الشريحة باهظة الثمن نسبيًا ، ولكن نظرًا لإمكانية إجراء التفاعلات بكميات أصغر ، يمكن توفير المال على الكواشف.

الشكل 2.6: نظرة عامة تخطيطية لطريقة Drop-seq (الصورة مأخوذة من Macosko et al)

الفكرة من الأساليب القائمة على القطيرات هي تغليف كل خلية فردية داخل قطيرة نانوليتر مع حبة. يتم تحميل الخرزة بالأنزيمات المطلوبة لبناء المكتبة. على وجه الخصوص ، تحتوي كل خرزة على رمز شريطي فريد يتم إرفاقه بجميع القراءات التي تنشأ من تلك الخلية. وبالتالي ، يمكن تجميع كل القطرات وتسلسلها معًا ويمكن بعد ذلك تخصيص القراءات لخلية الأصل استنادًا إلى الرموز الشريطية. عادةً ما تتمتع منصات Droplet بأعلى معدل نقل نظرًا لأن تكاليف إعداد المكتبة في حدود (. 05 ) دولار أمريكي / خلية. بدلاً من ذلك ، غالبًا ما تصبح تكاليف التسلسل عاملاً مقيدًا وتجربة نموذجية تكون التغطية منخفضة مع اكتشاف بضعة آلاف فقط من النصوص المختلفة (Ziegenhain et al. 2017).


النهج القائمة على الموائع الدقيقة

بدائل سير عمل Smart-Seq 2 هي طرق الموائع الدقيقة ، والتي تستخدم بيولوجيا جزيئية مماثلة (تعتمد أيضًا على تبديل القالب ، على سبيل المثال) ، ولكنها تختلف في التقاط الخلايا وإنتاجيتها. أثناء سير العمل المعتمد على القطيرات [7 ، 8] يتم تغليف الخلايا الفردية في قطرات نانولتر تحتوي على قراءات مشفرة بالحمض النووي للنسخ العكسي. بالنسبة لـ (كدنا) ، يتم تقسيم قطرات الاسترداد ، ويخضع (كدنا) لإعداد المكتبة. تسمح هذه الطريقة بتحديد ملامح آلاف الخلايا في وقت واحد ، ولكنها تطلبت في البداية معدات متخصصة ومصممة خصيصًا ، مما جعل من الصعب الوصول إليها. في الآونة الأخيرة ، تم إطلاق العديد من الأدوات القائمة على القطرات الصغيرة التي توفر منصات ملائمة لتحليل الخلية المفردة المستند إلى القطيرات مع توليف من 2-3 أيام. على سبيل المثال ، تقدم BioRad عازلًا أحادي الخلية ddSeq ، وهو مرتبط بمجموعات Illumina Nextera. يقدم InDrop بواسطة 1CellBio نظام موائع جزيئية بديل آخر. توفر منصة Fluidigm C1 موائع جزيئية منخفضة الإنتاجية مع ميزة القدرة على التحكم البصري في الآبار الفارغة أو المزدوجة بعد الالتقاط. ومع ذلك ، فإن النظام الأساسي الأكثر استخدامًا في الوقت الحالي هو وحدة التحكم أحادية الخلية من 10x Genomics ، وسنناقش خصائصها بشكل أكبر في هذه المراجعة. تم تصميم الأساليب المستندة إلى Microdroplet لتقييم عدد كبير من الخلايا وتهيئة نفسها لتحديد ملامح الأنسجة واكتشاف أنواع الخلايا الجديدة.

العوامل المهمة لتوليد بيانات ناجح وعالي الجودة باستخدام تقنية microdroplet هي جودة الخلايا وأرقام الخلايا المستخدمة في كل تجربة. من الناحية المثالية ، يتم تغذية الخلايا الحية فقط في النظام ، وبالتالي ، فإن العزل السريع والتفكك الخفيف لأنواع الخلايا أمر ضروري ويجب تجربته قبل الالتزام بالتجربة الفعلية (انظر أعلاه). يمكن اختبار الجدوى بشكل موثوق باستخدام طرق استبعاد الصبغة أو فرز FACS باستخدام علامة الخلية الحية / الميتة قبل تحميل الخلايا على الشريحة. يزداد عدد المضاعفات المغلفة في نفس القطرة (∼0.8٪ / 1000 خلية) مع ارتفاع أعداد الخلايا ويجب أخذها في الاعتبار. في الآونة الأخيرة ، أبلغ Alles وزملاؤه [9] عن طريقة تثبيت تعتمد على الميثانول من أجل التنميط النسخي للخلية المفردة باستخدام الموائع الدقيقة. تضمن هذه الطريقة الحفاظ على خصائص النسخ وهي مفيدة بشكل خاص عند العمل مع عينات سريرية نادرة أو عينات دورة زمنية ، حيث يجب أن تحدث المعالجة النهائية في نفس الوقت.


احتمالات RNA-Seq أحادية الخلية لأخذها

نظرًا لاعتبارات الوقت أو الميزانية أو الخبرة ، فإن تصميم وتنفيذ تحليلات scRNA-Seq الجديدة التي تتناول سؤال بحث مستهدف قد لا يكون دائمًا خيارًا. ومع ذلك ، توجد بالفعل أعداد كبيرة من مجموعات البيانات التجريبية ذات الوصول المفتوح ، في مراحل مختلفة من تنقيح البيانات. أحد الأمثلة المهمة هو أطلس تعبير الخلية المفردة ، والذي يقوم حاليًا بفهرسة أكثر من 150 تجربة scRNA-Seq عبر مختلف الأنسجة والأنواع ، ويسمح بالتنزيل المباشر للبيانات التجريبية التي تمثل أكثر من مليوني خلية. يمكن أيضًا استخراج موارد أخرى أكثر استهدافًا للحصول على بيانات تعبير عالية الجودة ، على سبيل المثال أطلس ألين برين.

مع إجراء أكثر من 850 تجربة RNA-seq أحادية الخلية حتى الآن ، فإن احتمالات العثور على البيانات ذات الصلة ببحثك مهمة. بصرف النظر عن التحليلات المستقلة لمجموعات البيانات العامة ، يمكن أيضًا تحليل البيانات المتاحة علنًا بالاقتران مع بياناتك الخاصة ، ودعم النتائج أو زيادتها.

عند التخطيط لمشروع scRNA-Seq ، من المهم أن تكون على دراية بالأدوات المتاحة وبيانات الوصول المفتوح ذات الصلة ، بالإضافة إلى إمكانيات وقيود النظام الأساسي أحادي الخلية المستخدم. تُعد مساعدتك في التخطيط لتجربة وتصميم سير عمل المعلوماتية الحيوية وفقًا لاحتياجاتك جزءًا أساسيًا من المعلوماتية الحيوية كخدمة لشركة Genevia Technologies.

اقرأ المزيد حول تحليلات النسخ التي نقدمها ، أو اترك لنا رسالة أدناه إذا كنت ترغب في مناقشة خططك أحادية الخلية معنا!